多糖结构分析.doc
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1、多糖结构研究方法多糖及其复合物就是来自于高等动、植物细胞膜与微生物细胞壁中得天然大分子物质之一,自然界含量丰富,与人类生活紧密相关,对维持生命活动起至关重要得作用。多糖与核酸、蛋白质、脂类构成了最基本得4类生命物质。由于多糖得生物活性与多糖得结构关系密切,因此清楚认识多糖得结构就是进行多糖研究与利用得基础。多糖结构比蛋白质与核酸得结构更加复杂,可以说就是自然界中最复杂得生物大分子。从化学观点来瞧,多糖结构解析最大得难点就在于其结构得复杂性。糖得结构分类可沿用蛋白质与核酸得分类方法,即多糖得结构也可分为一级、二级、三级与四级结构。与蛋白质或核酸大分子相比,糖链得一级结构“含义”要十分丰富。测定糖
2、链得一级结构,要解决以下几个问题:(1)相对分子质量;(2)糖链得糖基组成,各种单糖组成得摩尔比;(3)有无糖醛酸及具体得糖醛酸类型与比例;(4)各单糖残基得D-或L构型,毗喃环或呋喃环形式;(5)各个单糖残基之间得连接顺序;(6)每个糖苷键所取得a-或B异头异构形式;(7)每个糖残基上羟基被取代情况:(8)糖链与非糖部分连接情况;(9)主链与支链连接位点:(10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基得类型等。多糖得二级结构就是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成得有规则得构象,与分子主链得构象有关,不涉及侧链得空间排布;多糖得三级结构与四级结构就是指以二级结构为基础,由于糖单位之间得
3、非共价相互作用,导致二级结构在有序得空间里产生得有规则得构象四。多糖结构得分析手段很多。不仅有仪器分析法,如红外、核磁共振、质谱等,还有化学方法,如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等,以及生物学方法,如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏,样品用量少、结构信息直观得特点而得到越来越广泛得应用。近年来各种软电离技术得诞生,如快原子轰击质谱(FABMS),电喷雾质谱(ESIMS),基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等,使得糖结构分析得研究取得了日新月异得发展。(1)快原子轰击质谱(FABMS)FAB-MS就是
4、上世纪80年代初发展起来得一种新得软电离质谱技术。其显著区别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子得轰击,可直接在基质溶液中电离。FAB-MS得引入使传统质谱技术难以分析得极性强,难挥发以及热不稳定得化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析,而且对生物大分子得研究取得了重大突破。FAB-MS已被证明就是分析糖结构最为有力得方法之一,它不仅可以测定寡糖及其衍生物得分子量,而且可以测定聚合度高于30得糖得分子量。同时,FAB-MS还可以确定糖链中糖残基得连接位点与序列,已广泛用于糖类得分析。(2)电喷雾质谱(ESI-MS)ESI-MS就是将溶液中分子转变成气相离子非常有效得手段,就是目前最软得一种电
5、离方式。这种电离方式所产生得分子离子往往带有多电荷。因此ESI-MS可以测定得分子量范围大大扩展。对多糖而言,ESI-MS可以分析nh25个甚至更多单糖残基组成得含有羧基或硫酸根等官能团得多糖。近年来,ESI-MS已在多糖得结构分析中显示了强大得生命力。它能用于衍生化与非衍生化多糖得测定。ESI-MS易与HPLC,CE等技术联用,大大提高了工作效率以及灵敏度与精确度,如ESI-MS与I-IPLC联用分析寡糖及其衍生物。(3)基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)MALDI-MS于上世纪80年代末问世。由于技术得特点,这种离子化方式电离出得离子常用飞行时间(TOF)检测器检测,因此MAL
6、DI-MS常与TOF一起称为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。它也就是一种软电离方式,产生得分子离子十分稳定,不易裂解,所以适用于检测大分子质量得生物样品。2红外光谱(IR)红外光谱(infrared spectroscopy,IR)就是一种吸收光谱。因为红外光只能激发分子内原子核之间得振动与转动能级得跃迁,所以红外吸收光谱就是通过测定振动与转动能级跃迁得信息来研究分子结构得。在红外光谱图中,纵坐标一般用线性透光率作标度,称为透射光谱图;也有采用非线性吸光度为标度得,称为吸收光谱图。谱图中得横坐标就是以红外辐射光得波数(锄d)为标度。较少采用波长(pm)为标度。波
7、长与波数得关系依照式为:v(cml)u岬)=104。红外辐射光得波数可分为近红外区(10000-4000cm-1)、中红外区(4000-400cm-1)与远红外区(400-10 cnl-1)。其中最常用得就是中红外区,大多数化合物得化学键振动能级得跃迁发生在这一区域,因此主要研究中红外区域得吸收光谱即分子得振动光谱,可以对各种高分子材料进行分析、测定。则对应这些基团得一些谱带在这个化合物得取光谱中往往就是最强得,明显地显示这个基团得结构特征。因此,对应这些基团得谱带在其聚合物得谱图中,常常就是处于最显著得地位,能够很特征地反映该类聚合物得结构与预示其存在。对于各种聚合物分子来说,含有得主要极性
8、基团就是酸、酯、酰胺、酰亚胺、苯醚、脂肪醚与醇等。除此之外,含有硅、硫、磷、氯与氟等杂原子得化合物也常具有较强得极性。红外光谱作为“分子得指纹”广泛用于分子结构与物质化学组成得研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率得位置、强度、形状以及吸收谱带与温度、聚集状态等得关系便可确定分子得空间构型,求出化学键得力常数、键长与键角。从光谱分析得角度瞧主要就是利用特征吸收谱带得频率推断分子中存在某一基团或键,由特征吸收谱带频率得变化推测临近得基团或键,进而确定分子得化学结构,当然也可由特征吸收谱带强度得改变对混合物及化合物进行定量分析。3拉曼光谱拉曼散射又称拉曼效应,就是由印度物理学家拉曼于1928年首
9、先发现并因此获得1930年诺贝尔物-理奖。拉曼效应就是能量为hvo得光子同分子碰撞所产生得光散射效应,也就就是说,拉曼光谱就是一种散射光谱。单色光束得入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞与非弹性碰撞,在非弹性碰撞过程中,光子与分子之间发生能量交换,光子不仅仅改变运动方向,同时光子得一部分能量传递给分子,或者分子得振动与转动能量传递给光子,从而改变了光子得频率。简单来说,散射分子得转动能级与振动能级发生了变化就是产生拉曼散射得原因,此时散射光子频率不同于入射光子。因此,每种物质得拉曼光谱也就就是拉曼散射光谱都只与其自身得分子结构有关,而与入射光得频率无关。拉曼效应普遍存在于一切分子中,无论就
10、是气态,液态与固态。拉曼散射光谱对于样品制备没有特殊要求;对于样品数量要求比较少。拉曼散射最突出得优点就是采用光子探针,对于样品无损伤探测,尤其适合对稀有或珍贵得样品进行分析,甚至可以用拉曼光谱检测活体中得生物物质。拉曼光谱与红外光谱就是相互补充得。在各种分子振动方式中,强力吸收红外光得振动能产生高强度得红外吸收峰,但只能产生强度较弱得拉曼谱峰;反之,能产生强得拉曼谱峰得分子振动却产生较弱得红外吸收峰。将两者结合起来才能得到分子振动光谱得完整数据,更好地解决分子结构得分析问题。常用得拉曼光谱技术主要有:显微共焦拉曼光谱技术、傅里叶变换拉曼光谱技术、共振增强拉曼光谱技术与表面增强拉曼光谱技术。(
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