PCR影响因素.doc
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1、 影响PR 结果得因素() 引物: 引物就是PC特异性反应得关键, 产物得特异性取决于引物与模板DA互补得程度、设计引物应遵循以下原则:引物长度: 1-30bp,常用为20p左右。引物扩增跨度: 以200500为宜,特定条件下可扩增长至10k得片段。引物碱基:G含量以4060为宜,G+太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶 核苷酸得成串排列。避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带。引物3端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致
2、PCR失败。引物中有或能加上合适得酶切位点, 被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性、引物量:每条引物得浓度、11ml或11pmo,以最低引物量产生所需要得结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会。(2)酶及其浓度 目前有两种TaDN聚合酶供应, 一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶,另一种为大肠菌合成得基因工程酶、催化一典型得PCR反应约需酶量。5(指总反应体积为10ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。(3)dNTP得质量与浓度 dNT
3、P得质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系,dTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。NTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以M NaOH或M Tris、HCL得缓冲液将其 PH调节到7。0.5,小量分装, 0冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PC反应中,dNTP应为5000mlL,尤其就是注意种NT得浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配、浓度过低又会降低PC产物得产量、dTP能与Mg2+结合,使游离得+浓度降低。(4)模板(靶基因)核酸模板核酸得量与纯化程度,就是PR成败与否得关键环节之一,传统得NA纯化方法通常采用S与蛋白酶K
4、 来消化处理标本。DS得主要功能就是:溶解细胞膜上得脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中得核蛋白,D还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别就是与DN结合得组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质与其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取得核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便得方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体得蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RN模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止Ns降解RNA。(5)g2+浓度 Mg2对R扩增得特异性与产量有显著得影响,在一般得PR反应中,各种NP浓度为200mol
5、L时,2+浓度为1.52、0mm/L为宜、Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DA聚合酶得活性,使反应产物减少。(6)温度与时间得设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点、在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在9095变性,再迅速冷却至40 60,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至707,在TDNA 聚合酶得作用下,使引物链沿模板延伸、对于较短靶基因(长度为1000bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94变性,5左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高得催化活性)。变性温度与时间:变性
6、温度低,解链不完全就是导致PR失败得最主要原因、一般情况下,9394lmin足以使模板DNA变性,若低于93则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶得活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PC失败。退火(复性)温度与时间:退火温度就是影响PCR特异性得较重要因素。变性后温度快速冷却至46,可使引物与模板发生结合。由于模板DA比引物复杂得多,引物与模板之间得碰撞结合机会远远高于模板互补链之间得碰撞。退火温度与时间,取决于引物得长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列得长度。对于20 个核苷酸,GC含量约5得引物,55为选择最适退火温度得起点较为理想。引物得复性温度可通
7、过以下公式帮助选择合适得温度:值(解链温度)=(G+C)+(A+)复性温度=T值(5)在Tm值允许范围内, 选择较高得复性温度可大大减少引物与模板间得非特异性结合,提高PC反应得特异性。复性时间一般为360se,足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间:Taq DN聚合酶得生物学活性:7080 150 核苷酸/S/酶分子7 核苷酸S酶分子55 24核苷酸S酶分子高于90时, A 合成几乎不能进行。PC反应得延伸温度一般选择在705之间,常用温度为7,过高得延伸温度不利于引物与模板得结合。CR延伸反应得时间,可根据待扩增片段得长度而定,一般1Kb以内得DA片段,延伸时间min就是足够 得、k
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