光谱解析基础知识.pdf

Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential1光谱解析基础知识Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential2主要包括以下四个方面：主要包括以下四个方面：?高压液相色谱高压液相色谱?核磁共振波谱法核磁共振波谱法?质谱解析基础知识质谱解析基础知识?催化氢化催化氢化Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential32-1 高压液相色谱一、液相色谱理论发展概况高 效 液 相 色 谱 法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。又因分析 速 度 快 而 称 为 高 速 液 相 色 谱 法（High Speed Liquid Chromatography，HSLP）。也称现代液相色谱。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential4二、二、HPLC的特点和优点的特点和优点1.HPLC有以下特点1.HPLC有以下特点：高 压高 压 压 力 可 达 150300 Kg/cm2。高 速 流 速 为0.110.0 ml/min。高效高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01 ng。同时消耗样品少。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential52.HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快2.HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高灵敏度高紫外检测器可达0.01 ng，荧光和电化学检测器可达0.1 pg。柱子可反复使用柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential6三、正常相色谱法三、正常相色谱法在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液固色谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential7四、反相色谱法四、反相色谱法在反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链碳氢化合物，如正辛基等。流动相的极性比固定相的极性强。反相色谱法在高效液相色谱法中应用最广泛。在反相色谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential8正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential9五、五、HPLC应用应用1.保留时间1.保留时间 进样到峰极大值所对应的时间。2.定性分析2.定性分析 定性是确定组分的性质。3.定量分析3.定量分析 定量就是确定组分的含量。(1)归一化法(1)归一化法某组分的百分含量Pi%，等于改组分的色谱峰面积Ai乘上相对矫正因子fi，并除以各组分色谱峰的面积与相应组分的相对矫正因子的乘积总和，可用公式表示如下Pi=(Aifi/Aifi)100%Aifi=A1f1+Aifi+Anfn(1.1)Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential10(2)外标法(2)外标法本方法系配制一定浓度的标准样进行色谱分析，测得各组分的峰高或峰面积对浓度的标准曲线，然后再与标准样同样的操作条件下分析试样并与标准样进行比较。根据上述实验结果，从对应标准曲线计算出试样的浓度。(3)内标法(3)内标法若测定样品中的某一组分或某几个组分的含量，可以把一定量的某一种纯物质，加入到样品中作为内标物，然后进行色谱定量计算。通过测出内标物的峰面积和欲测定的组分的峰面积后，计算该组分的含量。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential112-2 核磁共振波谱法一、核磁共振波谱法（NMR）简介1953年出现第一台核磁共振商品仪器以来，核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面有着飞跃的进步。谱仪频率已从30MHz发展到900MHz。二、核磁共振的产生0Bhh=20B=Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential12三、核磁共振参数1.化学位移1.化学位移()=120Bsapd+=610=标准样品标准BBB6061010=标准样品标准标准样品Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential132.耦合常数2.耦合常数(1)自旋(1)自旋-自旋耦合引起峰的裂分（分裂）自旋耦合引起峰的裂分（分裂）一般情况下，核磁共振谱都呈现谱峰的分裂，称之为峰的裂分。产生峰的裂分的原因在于核磁矩之间的相互作用，这种作用称为自旋-自旋耦合作用。自旋耦合引起的谱线裂分有以下规律：受耦合作用而产生的谱线裂分数为n+1，n表示产生耦合的原子核（其自旋量子数为1/2）的数目，这称为n+1规律。若考虑一般情况，因受自旋量子数为I的n个原子核耦合，产生的谱线数目为2nI+1，这称为2nI+1规律。n+1规律是2nI+1规律的特例(I=1/2)，却是最经常使用的。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro CSpanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential15(1)耦合常数(1)耦合常数核磁谱图谱线裂分所产生的裂距是相等的，它反映了核之间耦合作用的强弱，称为耦合常数J，以Hz为单位。耦合常数J反映的是两个核之间作用的强弱，故其数值与仪器的工作频率无关。(1)其它参数(1)其它参数峰面积峰面积反映了某种（官能团）原子核的定量信息。图2是化合物CH3CH2OCOCH2CH2COOCH2CH3的氢谱，因而各含氢官能团均有相应的峰组。图中从左到右的三组峰，分别为-CH2-CH3的亚甲基、CH2-CH2和CH3的谱峰。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential16图2 丁二酸二乙酯的氢谱图2 丁二酸二乙酯的氢谱Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential17四、样品的制备四、样品的制备对于核磁共振氢谱的测量，应采用氘代试剂以便不产生干扰信号。对低、中极性的样品，最常采用氘代氯仿作溶剂，因其价格远低于其它氘代试剂。极性大的化合物可采用氘代丙酮、重水等。针对一些特殊的样品，可采用相应的氘代试剂：如氘代苯（用于芳香化合物、芳香高聚物）、氘代二甲基亚砜（用于某些在一般溶剂中难溶的物质）、氘代吡啶（用于难溶的酸性或芳香化合物）等。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential18五、谱图解析1.一级谱图五、谱图解析1.一级谱图可用n+1规律来分析。一级谱具有下列特点：峰的数目可用n+1规律描述。需要注意的是，n+1规律是对应一个固定的J而言的。若所讨论的核组相邻n个氢，但与其中n1个氢有耦合常数J1，与其余的n2个氢有耦合常数J2(n1+n2=n)，则所讨论的核组具有（n1+1）(n2+1)个峰，其余类推。峰组内各峰的相对强度可用二项式展开系数近似地表示。从图可直接读出和J。峰组中心位置为。相邻两峰间距为J（以Hz计）。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential19CH3CCH2COCH2CH3OOa b c d2.2 3.5 4.1 1.2(s)(s)(q)(t)Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential20如果邻近不同的核与所研究的核之间有着接近或相同的偶合常数如果邻近不同的核与所研究的核之间有着接近或相同的偶合常数,那么谱线分裂的数目为那么谱线分裂的数目为(n+n+1)。CH3CH2CH2I a b Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential21(1)烷氢(1)烷氢烷氢的化学位移常在3以下(2)芳氢(2)芳氢芳氢的化学位移一般在6-9之间，常出现在7左右。(3)烯氢(3)烯氢烯氢谱峰处于烷基与苯环氢谱峰之间。(4)活泼氢(4)活泼氢因氢键的作用，活泼氢的出峰位置不定，与样品浓度、介质、作图温度等有关，重氢交换可去掉活泼氢的谱峰，由此可以确认其存在。2.常见官能团的氢谱2.常见官能团的氢谱Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential22质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子气态离子并按 质质荷比荷比（m/z）大小）大小 进行分离记录的分析方法。所获得结果即为质谱图质谱图（亦称质谱）。根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。质谱仪早期主要用于原子量的测定和定量测定某些复杂碳氢混合物中的各组分等。1960年以后，才开始用于复杂化合物的鉴定和结构分析。实验证明，质谱法是研究有机化合物结构的有力工具。2-3质谱解析基础知识质谱解析基础知识Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential23一、质谱仪的工作原理一、质谱仪的工作原理质谱仪是利用电磁学原理电磁学原理，使带电带电的样品离子样品离子按质荷质荷比比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷 z 有关，即z e U=1/2 m 2其中z为电荷数，e为元电荷（e=1.6010-19C），U为加速电压，m为离子的质量，为离子被加速后的运动速度。具有速度具有速度 的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/zm/z进行分进行分离离。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential24二、质谱仪的基本结构二、质谱仪的基本结构质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的m/z m/z 的离子来进行分离分析的。质谱仪包括进样系统进样系统、电离系统电离系统、质量分析系统质量分析系统和检测系统检测系统。为了获得离子的良好分析，避免离子损失，凡有样品分子及离子存在和通过的地方，必须处于真空状态真空状态。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential251、气相色谱1、气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪(Gas chromatography-Mass spectrometer,GC-MS)GC-MS主要由三部分组成：色谱部分、质谱部分和数据处理系统。色谱部分和一般的色谱仪基本相同，包括有柱箱、汽化室和载气系统，也带有分流/不分流进样系统，程序升温系统、压力、流量自动控制系统等，一般不再有色谱检测器，而是利用质谱仪作为色谱的检测器。在色谱部分，混合样品在合适的色谱条件下被分离成单个组分，然后进入质谱仪进行鉴定。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential262、液相色谱2、液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪(Liquid chromatography Mass spectrometer,LC-MS)LC-MS联用仪主要由高效液相色谱，接口装置（同时也是电离源），质谱仪组成。高效液相色谱与一般的液相色谱相同，其作用是将混合物样品分离后进入质谱仪。此处仅介绍接口装置和质谱仪部分。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential271）.LC-MS接口装置1）.LC-MS接口装置LC-MS联用的关键是LC和MS之间的接口装置。接口装置的主要作用是去除溶剂并使样品离子化。早期曾经使用过的接口装置有传送带接口，热喷雾接口，粒子束接口等十余种，目前，几乎所有的LC-MS联用仪都使用大气压电离源作为接口装置和离子源。大气压电离源（Atmosphere pressure Ionization，API）（Atmosphere pressure Ionization，API）包括电喷雾电离源（ElectrosprayIonization，ESI）（ElectrosprayIonization，ESI）和大气压化学电离源（Atmospheric Pressure Chemicel Ionization，APCI）（Atmospheric Pressure Chemicel Ionization，APCI）两种，二者之中电喷雾源应用最为广泛。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential282）.质谱仪部分2）.质谱仪部分由于接口装置同时就是离子源，因此质谱仪部分只介绍质量分析器。作为LC-MS联用仪的质量分析器种类很多，最常用的是四极杆分析器（简写为Q），其次是离子阱分析器（Trap）和飞行时间分析器（TOF）。因为LC-MS主要提供分子量信息，为了增加结构信息，LC-MS大多采用具有串联质谱功能的质量分析Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential29三、质谱解析基础知识三、质谱解析基础知识由于电子电离源（EI）得到的质谱和软电离源质谱有很大差别，故将二者分开叙述。1.EI质谱中的各种离子(1)分子离子在电子轰击下，有机物分子失去一个电子所形成的离子叫分子离 子。质谱中的各种离子(1)分子离子在电子轰击下，有机物分子失去一个电子所形成的离子叫分子离 子。M+e M+2e(2)碎片离子碎片离子碎片离子是分子离子碎裂产生的。当然，碎片离子还可以进一步碎裂形成更小的离子。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential302、EI质谱的解析质谱的解析(1)分子量确定分子量确定A 分子离子峰一定是质谱中质量数最大的峰，它应处在质谱的最右端。B 分子离子峰应具有合理的质量丢失。C 分子离子应为奇电子离子，它的质量数应符合氮规则。如果某离子峰完全符合上述三项判断原则，那么这个离子峰可能是分子离子峰；如果三项原则中有一项不符合，这个离子峰就肯定不是分子离子峰。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential313.化学电离源质谱化学电离源质谱(1)快原子轰击源质谱快原子轰击源质谱快原子轰击质谱主要是准分子离子，碎片离子较少。常见的离子有(M+H)+、(M-H)-。此外，还会生成加合离子，最主要的加合离子有(M+Na)+、(M+K)+等。(2)电喷雾质谱电喷雾质谱电喷雾电离质谱(Electrospray Ionization，ESI)既可以分析小分子，又可以分析大分子。对于分子量在1000Da以下的小分子，通常是生成单电荷离子，少量化合物有双电荷离子。碱性化合物如胺易生成质子化的分子(M+H)+，而酸性化合物，如磺酸，能生成去质子化离子(M-H)-。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential32由于电喷雾是一种很软的电离技术，通常很少或没有碎片。谱图中只有准分子离子，同时，某些化合物易受到溶液中存在的离子的影响，形成加合离子。常见的有(M+NH4)+、(M+Na)+及(M+K)+等。大气压化学电离源（APCI）得到的主要是单电荷离子，通过质子转移，样品分子可以生成(M+H)+或(M-H)-。Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential33四、本公司分析组提供的质谱测试服务四、本公司分析组提供的质谱测试服务1.ESI/APCI-MS可获得分子量，提供定性参考，适合于纯度较高的样品2 LC-MS可获得组分百分含量及分子量，提供定性及定量参考。(前者ESI/APCI-MS是不经色谱柱，后者是经过柱分离。)Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential341-5 催化氢化一、起源催化氢化一、起源沙巴第艾在1897年发现烯类化合物可以在镍的存在下用氢气还原成为饱和烃以来，催化氢化已得到很大的发展。现在它已经成为有机合成中最重要的还原方法之一，工业上也已大量采用。二、催化氢化分类1.低压氢化二、催化氢化分类1.低压氢化1-4个大气压较低温度2.高压氢化。2.高压氢化。100-300个大气压较高温度Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential35三、催化氢化活性三、催化氢化活性各种可还原的基团，对于催化氢化的活性次序，与催化剂的品种有关，与反应的温度，压力，溶剂等条件有关，也与被还原物中的其它基团对反应基团的影响有关。但催化氢化的大致难易有下列的次序（括弧内表示氢化产物）：R-CO-Cl(R-CHOCHO)R-NO2(R-NHNH2 2)R-CC-R(R-CCCC-R)R-CHO(RCHCH2 2OHOH)R-CC-R(R-CHCH2 2-CH-CH2 2-R)R-CO-R(R-CHOHCHOH-R)Ph-CH2-O-R(Ph-CHPh-CH3 3+R-OH+R-OH)R-CN(R-CHCH2 2-NH-NH2 2)R-CO-OR(R-CHCH2 2OHOH+R R-OH-OH)R-CO-NH-R(R-CHCH2 2-NH-R-NH-R)Ph Spanning Drug Development&the GlobeBioDuro Confidential36四、催化氢化的操作步骤1.加料四、催化氢化的操作步骤1.加料选择合适的溶剂（常用的为质子性溶剂，如乙醇、甲醇、乙酸等，必要时可加几滴盐酸催化），加入反应物和催化剂。2.换气2.换气用惰性气体置换出反应器中的空气。3.通氢气3.通氢气先用氢气置换出反应器中的惰性气体，再充满氢气。