幽门螺杆菌在胃癌发生过程中的作用机制.docx

幽门螺杆菌在胃癌发生过程中的作用机制【摘要】 目的： 探讨Hp可能的致癌机制. 方法： 采用WarthinStarry嗜银染色法检测胃癌组织39例，胃黏膜不典型增生24例和慢性胃炎组织33例中的Hp感染情况；采用PCR法检测上述标本中HpcagA；采用免疫组化SP法检测组织中iNOS, VEGF, cerbB2和ras癌基因产物p185和p21的表达. 结果： Hp, HpcagA, iNOS, VEGF, p185和p21在不典型增生和胃癌组织中的表达显着高于慢性胃炎组织；Hp阳性慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中iNOS, VEGF和p21的表达显着高于Hp阴性组，Hp阳性不典型增生及胃癌组织中p185的表达显着高于Hp阴性组；慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中Hp与iNOS，VEGF和p21表达呈正相关，不典型增生和胃癌组织中Hp与p185表达呈正相关. 结论： Hp的致癌作用与其HpcagA的过度表达，增强胃黏膜细胞中iNOS和VEGF的表达，促进胃黏膜细胞癌基因cerbB2和ras的活化密切相关.【关键词】 胃肿瘤；血管内皮生长因子类；一氧化氮合酶；癌基因；螺杆菌，幽门；细胞毒素相关基因0引言幽门螺杆菌感染与胃癌的发生发展密切相关1，2，但Hp确切的致癌机制尚不清楚. 我们通过对慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中Hp和细胞毒素相关基因阳性株感染率，诱导型一氧化氮合酶，血管内皮生长因子，cerbB2和ras癌基因产物p185和p21蛋白表达情况及Hp与iNOS, VEGF, p185和p21蛋白表达的相关性研究，探讨Hp可能的致癌机制.1材料和方法材料解放军第5医院200201/200312纤维内窥镜活检存档蜡块标本96例，胃癌39例，男32例，女7例，平均年龄岁；胃黏膜不典型增生24例，男17例，女7例，平均年龄岁；慢性胃炎33例，男14例，女19例，平均年龄岁.方法标本40 g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 m厚连续切片. Hp感染采用WarthinStarry嗜银染色，Hp呈棕黑色，弯曲成弧形、S形或海鸥状，多位于胃粘膜表面和/或胃小凹及胃癌旁黏膜腺窝内. HpcagA基因的检测采用PCR法. cagA引物序列： 引物1： 5GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG3，引物2： 5CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；TagDNA酶、PCR染液购自北京赛百圣基因技术有限公司；dNTP购自南京生兴生物技术有限公司. 取石蜡块切片3片，经二甲苯脱蜡后，消化液消化，酚氯仿抽提DNA，-20备用. PCR反应体系为50 L，包括DNA模板2 L, cagA引物1 L, cagA引物2L, TagDNA酶 L, 10Tag缓冲液5 L, PCR染液5 L, dNTP 1 L, ddH2O 35 L. PCR反应条件： 95预变性4 min后，95变性60 s, 50退火60 s, 72延伸60 s，共30个循环，循环结束后72延伸7 min. 反应结束后取13 L扩增水相用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，在349 bp出现电泳带为阳性，否则为阴性.iNOS, VEGF, p185和p21的表达 采用免疫组化SP法. 实验试剂iNOS兔抗人多克隆抗体、人抗兔免疫组化试剂盒、iNOS阳性对照片购自武汉博士德公司；VEGF, p185和p21鼠抗人mAb，免疫组化试剂盒及DAB显色液，iNOS，VEGF，p185和p21阳性对照片购自福州迈新生物技术有限公司. 阴性对照以PBS代替第一抗体，操作方法均按试剂盒说明书进行. iNOS和VEGF主要为细胞质着色，p185和p21癌基因蛋白主要表达在细胞质和/或细胞膜，以上部位出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，计数5个高倍视野，以阳性细胞数所占比例分为“-”： 阳性细胞数5%；“+”： 5%阳性细胞数25%；“”： 25%阳性细胞数50%.统计学处理： 采用计算机统计分析软件进行，胃黏膜组织Hp和HpcagA+表达情况，Hp与iNOS, VEGF, p185和p21表达的关系采用2检验，iNOS, VEGF, p185和p21表达情况采用秩和检验，Hp与iNOS, VEGF, p185和p21表达的相关性采用Spearman等级相关分析.2结果胃黏膜不典型增生和胃癌组织中Hp和HpcagA+株感染率显着高于慢性胃炎组织；不典型增生和胃癌组织中iNOS, VEGF, p185和p21的表达显着高于慢性胃炎组织；Hp阳性慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中iNOS，VEGF和p21的表达显着高于Hp阴性组，Hp阳性不典型增生及胃癌组织中p185的表达显着高于Hp阴性组；慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中Hp与iNOS, VEGF和p21表达呈正相关，不典型增生和胃癌组织中Hp与p185表达呈正相关. 表1胃黏膜组织Hp和HpcagA (+)株感染率表2胃黏膜组织iNOS, VEGF, p185和p21的表达表3胃黏膜组织Hp与iNOS, VEGF, p185和p21表达的关系表4Hp与iNOS, VEGF, p185和p21表达的相关分析3讨论Hp感染后可能是通过其产生的细胞毒素，使组织损伤，胃黏膜上皮恶性转化. CagA表达的cagA蛋白是Hp产生的主要细胞毒素. CagA阳性的菌株感染与胃癌的发生密切相关3，4. 本研究结果显示，胃黏膜不典型增生和胃癌组织中Hp和HpcagA+株感染率显着高于慢性胃炎组织，证实Hp感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子，cagA的存在与Hp的致癌作用密切相关. iNOS通过促进细胞增生，促进肿瘤血管形成，增加肿瘤细胞侵袭、转移等机制参与胃癌的发生、发展过程5. VEGF是一种内皮细胞的特异有丝分裂原，可特异性促进血管内皮细胞分裂增殖并增加血管通透性，与胃癌发生、发展密切相关6. 我们研究发现，不典型增生和胃癌组织中iNOS和VEGF的表达显着高于慢性胃炎组织；Hp阳性慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中iNOS和VEGF的表达显着高于Hp阴性组；慢性胃炎、胃粘膜不典型增生及胃癌组织中Hp感染与iNOS和VEGF的表达呈正相关. 表明iNOS和VEGF在胃癌的发生发展过程中起促进作用；Hp感染可增强胃黏膜细胞中iNOS和VEGF的表达. 在正常情况下癌基因cerbB2和ras处于非激活状态, 与细胞生长分化过程中信号转导有关. 当受到某些致癌因素作用后,其构型改变或表达失控而被激活，导致细胞信号转导发生障碍，引起胃癌发生7，8. 癌基因cerbB2和ras通过其产物基因蛋白p185和p21来表达其功能. 本结果显示，不典型增生和胃癌组织中p185和p21的表达显着高于慢性胃炎组织，证实癌基因cerbB2和ras的扩增导致p185和p21蛋白过度表达与胃癌的发生、发展有关. 我们还发现，Hp阳性胃黏膜不典型增生及胃癌组织中p185蛋白的表达显着高于Hp阴性组；胃黏膜不典型增生及胃癌组织中Hp与p185蛋白表达呈正相关. Hp阳性慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中p21蛋白的表达显着高于Hp阴性组，慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中Hp与p21蛋白的表达呈正相关. 说明Hp感染可引起胃黏膜细胞的癌基因cerbB2和ras活化或突变，使细胞增殖加快，促进胃癌发生发展.【参考文献】1Takeuchi K, Ohno Y, Tsuzuki Y, et al. Helicobacter pylori infection and early gastric cancer J. J Clin Gastroenterol, 2003；36：321-324.2Yao YL, Xu B, Song YG, et al. Overexpression of cyclin E in Mongolian gerbil with Helicobacter pyloriinduced gastric precancerosis J. World J Gastroenterol, 2002；8：60-63.3Wu AH, Crabtree JE, Bernstein L, et al. Role of Helicobacer pylori CagA+ strains and risk of adenocarcinoma of the stomath and esophagus J. Int J Cancer, 2003；103：815-821.4张勇，曾维政，蒋明德，等. 胃癌组织中Hp cagA基因表达J. 第四军医大学学报，2002；23：451-454.Zhang Y, Zeng WZ , Jiang MD, et al. Expression of Hp cagA gene in gastric carcinoma tissues J. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23：451-454.5Shen J, Wang RT, Wang LW, et al. A novel genetic polymorphism of inducible nitric oxide synthase is associated with an increased risk of gastric cancer J. World J Gastroenterol, 2004；10：3278-3283.6 Gong W, Wang L, Yao JC, et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription 3 predicts expression of vascular endothelial growth factor in and angiogenic phenotype of human gastric cancer J. Clin Cancer Res, 2005；11：1386-1393.7Jiang YA, Zhang YY, Luo HS, et al. Mast cell density and the context of clinicopathological parameters and expression of p185, estrogen receptor, and proliferating cell nuclear antigen in gastric carcinoma J. World J Gastroenterol, 2002；8：1005-1008.8Seo YH, Joo YE, Choi SK, et al. Prognostic significance of p21 and p53 expression in gastric cancer J. Korean J Intern Med, 2003；18：98-103.