化学色谱分析导论.pptx
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1、第十一章第十一章 色色谱法法导论11-1 11-1 概述概述 色色谱法法是是一一种种分分离离技技术,这种种分分离离技技术应用用于于分分析析化化学学,就就是是色色谱分分析析。它它适适用用于于有有机机混混合合物物的的分分离离提提纯和和分分析析测定定,在在中中药分分析析领域有着广泛的用途。域有着广泛的用途。由由于于同同学学们对色色谱这个个名名词很很陌陌生生,先先举一一个个例例子子,对色色谱分分析析的的整整个个过程程作作一一简单说明。明。一、色一、色谱法定法定义 基基于于物物质各各种种物物理理化化学学的的性性质的的微微小小差差异异,使使组分分在在流流动相相和和固固定定相相两两相相之之间的的分分布布系系
2、数数不不同同,而而当当两两相相作作相相对运运动时,组分分在在两两相相间进行行连续多多次次分分配配,实现组分分分分离离,达达到到彼彼此此分离的目的。分离的目的。通常根据根据以下几种性通常根据根据以下几种性质的差异:的差异:溶解度溶解度 分子极性分子极性 分子大小分子大小 吸附力吸附力 交交换能力能力 立体立体结构构 二、色二、色谱法法简介介 早早在在1903年年由由俄俄国国植植物物学学家家分分离离植植物物色色素素时首先采用。首先采用。后来不仅用于分离有色物质,还用于分离无色后来不仅用于分离有色物质,还用于分离无色物质,并出现了种类繁多的各种色谱法。物质,并出现了种类繁多的各种色谱法。194119
3、41年年MartinMartin和和Synge Synge 发明了气相色谱,从色发明了气相色谱,从色谱过程的热力学角度出发,提出了塔板理论,谱过程的热力学角度出发,提出了塔板理论,19521952年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。19561956年荷兰学者年荷兰学者Van Deemter Van Deemter 从从色谱过程的从从色谱过程的动力学角度出发,提出了速率理论。动力学角度出发,提出了速率理论。目前色谱法已广泛应用于许多领域,成为十分目前色谱法已广泛应用于许多领域,成为十分重要的分离分析手段。重要的分离分析手段。二、色二、色谱过程的特点程的特点1 任任何何色色谱过程程,都都具具有
4、有两两个个相相:不不动的的一一相相,称称一一为固固定定相相;另另一一相相是是携携带样品品流流过固固定定相相的的流流动体体,称称为流流动相。相。2 当当流流动相相中中样品品混混合合物物经过固固定定相相时,就就会会与与固固定定相相发生生作作用用,由由于于各各组分分在在性性质和和结构构上上的的差差异异,与与固固定定相相的的作作用用力力不不同同,因因此此固固定定相相滞滞留留时间长短短不不同同,从而达到分离。从而达到分离。14-214-2 色色谱法分法分类气气体体为流流动相相的的色色谱称称为气气相相色色谱(GCGC),根根据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂还是是固固定定液液(附附着着在在惰惰性性载体
5、体上上的的一一薄薄层有有机机化化合合物物液液体体),又又可可分分为气气固固色色谱(GS GS C C)和和气气液液色色谱(GLCGLC)液液体体为流流动相相的的色色谱称称液液相相色色谱(LCLC)。同同理理,液液相相色色谱亦亦可可分分为液液固固色色谱(LSCLSC)和液液色)和液液色谱(LLCLLC)。)。1 1按两相状态分类按两相状态分类2 2按分离机理分按分离机理分类 利利用用组分分在在吸吸附附剂(固固定定相相)上上的的吸吸附附能能力力强弱弱不不同而得以分离的方法,称同而得以分离的方法,称为吸附色吸附色谱法。法。利利用用组分分在在固固定定液液(固固定定相相)中中溶溶解解度度不不同同而而达达
6、到到分离的方法称分离的方法称为分配色分配色谱法。法。利利用用组分分在在离离子子交交换剂(固固定定相相)上上的的亲和和力力大大小小不同而达到分离的方法,称不同而达到分离的方法,称为离子交离子交换色色谱法。法。利利用用大大小小不不同同的的分分子子在在多多孔孔固固定定相相中中的的选择渗渗透透而而达到分离的方法,称达到分离的方法,称为凝胶色凝胶色谱法或尺寸排阻色法或尺寸排阻色谱法。法。最最近近,又又有有一一种种新新分分离离技技术,利利用用不不同同组分分与与固固定定相相(固固定定化化分分子子)的的高高专属属性性亲和和力力进行行分分离离的的技技术称称为亲和色和色谱法,常用于蛋白法,常用于蛋白质的分离。的分
7、离。3 3按固定相的外形分按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色固定相装于柱内的色谱法,称法,称为柱色柱色谱。固定相呈平板状的色固定相呈平板状的色谱法,称法,称为平板色平板色谱,它又可分它又可分为层色色谱和和纸色色谱。11-3 11-3 色色谱流出曲流出曲线及有关及有关术语一流出曲一流出曲线和色和色谱峰峰 如果如果进样量很小,量很小,浓度很低,在吸附等温度很低,在吸附等温线的的线性范性范围内,色内,色谱峰如果峰如果对称,可用称,可用GaussGauss正正态分分布函数表示:布函数表示:式式中中:C C不不同同时间t t时某某物物质的的浓度度,C C0 0进样浓度,度,t tr r保留保留时间,
8、标准偏差。准偏差。二、基二、基线 是柱中是柱中仅有流有流动相通相通过时,检测器响器响应讯号的号的记录值,稳定的基定的基线应该是一条水平直是一条水平直线 三、峰高三、峰高 色色谱峰峰顶点与基点与基线之之间的垂直距离,以的垂直距离,以h h表示表示四、保留四、保留值1 1死死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物不被固定相吸附或溶解的物质进入色入色谱柱柱时,从,从进样到出到出现峰极大峰极大值所需的所需的时间称称为死死时间。因。因为这种物种物质不被固定相吸不被固定相吸附或溶解,故其流附或溶解,故其流动速度将与流速度将与流动相的流相的流动速度相近速度相近测定流定流动相平均相平均线速速 时,可,可用
9、柱用柱长L L与与t tM M的比的比值计算。算。2 2保留保留时间t tR R 试样从从进样开始到柱后出开始到柱后出现峰极大峰极大点点时所所经历的的时间,称,称为保留保留时间,它,它相相应于于样品到达柱末端的品到达柱末端的检测器所需的器所需的时间 3调整保留时间调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间,即称为该组份的调整保留时间,即 tR=tR-tM 由由于于组份份在在色色谱柱柱中中的的保保留留时间t tR R包包含含了了组份份随随流流动相相通通过柱柱子子所所需需的的时间和和组份份在在固固定定相相中中滞滞留留所所需需的的时间,所所以以
10、t tR R实际上上是是组份份在在固固定定相相中中停停留留的的总时间保保留留时间可可用用时间单位位(如如s s)或或距距离离单位位(如如cmcm)表示。表示。保留保留时间是色是色谱法定性的基本依据,但法定性的基本依据,但同一同一组份的保留份的保留时间常受到流常受到流动相流速的影相流速的影响,因此色响,因此色谱工作者有工作者有时用保留体用保留体积等参数等参数进行定性行定性检定定 4 4死体死体积 V VM M 指指色色谱柱柱在在填填充充后后,柱柱管管内内固固定定相相颗粒粒间所所剩剩留留的的空空间、色色谱仪中中管管路路和和连接接头间的的空空间以以及及检测器器的的空空间的的总和和当当后后两两项很很小
11、小而而可可忽忽略略不不计时,死死体体积可可由由死死时间与流与流动相体相体积流速流速F F0 0(L Lminmin)计算:算:V VM M=t=tM MF F0 0 5 5保留体保留体积 V VR R 指从指从进样开始到被开始到被测组份在柱后出份在柱后出现浓度极大点度极大点时所通所通过的流的流动相体相体积。保留体。保留体积与保留与保留时间t t。的关系如下:。的关系如下:V VR R=t=tR RF F0 0 6 6调整保留体整保留体积V VR R 某某组份份的的保保留留体体积扣扣除除死死体体积后后,称称该组份的份的调整保留体整保留体积,即,即 V VR R=V=VR R-V-VM M 7 7
12、相相对保留保留值2.12.1 某某组份份2 2的的调整整保保留留值与与组份份1 1的的调整整保保留留值之比,称之比,称为相相对保留保留值:选择因子因子 在定性分析中,通常固定一个色在定性分析中,通常固定一个色在定性分析中,通常固定一个色在定性分析中,通常固定一个色谱谱峰作峰作峰作峰作为标为标准准准准(s s),然后再求其它峰(),然后再求其它峰(i i)对这个峰的相个峰的相对保留保留值此此时,r ri/si/s可能大于可能大于1 1,也可能小于,也可能小于1 1在多元混合在多元混合物分析中,通常物分析中,通常选择一一对最最难分离的物分离的物质对,将它,将它们的相的相对保留保留值作作为重要参数在
13、重要参数在这种特殊情况下,可种特殊情况下,可用符号用符号表示:表示:式中式中t tR2R2为后出峰的后出峰的调整保留整保留时间,所,所以以这时总是大于是大于1 1的的 。五、区域五、区域宽度度 色色谱峰的区域峰的区域宽度是度是组份在色份在色谱柱中柱中谱带扩张的函数,它反映了色的函数,它反映了色谱操作条件的操作条件的动力学因素度量色力学因素度量色谱峰区域峰区域宽度通常有三种度通常有三种方法:方法:1.1.标准偏差准偏差 即即0 0607607倍峰高倍峰高处色色谱峰峰宽的一半。的一半。2.2.半峰半峰宽W W1/2 1/2 即峰高一半即峰高一半处对应的峰的峰宽它与它与标准偏差准偏差的关系是:的关系
14、是:W W1/21/2=2.354=2.3543.3.基基线宽度度W W 即即色色谱峰峰两两侧拐拐点点上上的的切切线在在基基线上的截距它与上的截距它与标准偏差。的关系是:准偏差。的关系是:W=4 W=4 从色从色谱流出曲流出曲线上,可以得到上,可以得到许多重要信息:多重要信息:(1)(1)根根据据色色谱峰峰的的个个数数,可可以以判判断断样品品中中所所合合组 份的最少个数份的最少个数 (2)(2)根根据据色色谱峰峰的的保保留留值(或或位位置置),可可以以进行行定性分析定性分析 (3)(3)根根据据色色谱峰峰下下的的面面积或或峰峰高高,可可以以进行行定定量分析量分析 (4)(4)色色谱峰峰的的保保
15、留留值及及其其区区域域宽度度,是是评价价色色谱柱分离效能的依据柱分离效能的依据 (5)(5)色色谱峰两峰峰两峰间的距离,是的距离,是评价固定相价固定相(和流和流动相相)选择是否合适的依据是否合适的依据 11-4 11-4 色色谱法分析的基本原理法分析的基本原理 色色谱分析的目的是将分析的目的是将样品中各品中各组分彼分彼此分离,此分离,组分要达到完全分离,两峰分要达到完全分离,两峰间的的距离必距离必须足足够远,两峰,两峰间的距离是由的距离是由组分分在两相在两相间的分配系数决定的,即与色的分配系数决定的,即与色谱过程的程的热力学性力学性质有关。但是两峰有关。但是两峰间虽有一有一定距离,如果每个峰都
16、很定距离,如果每个峰都很宽,以致彼此重,以致彼此重叠,叠,还是不能分开。是不能分开。这些峰的些峰的宽或窄是由或窄是由组分在色分在色谱柱中柱中传质和和扩散行散行为决定的,决定的,即与色即与色谱过程的程的动力学性力学性质有关。因此,有关。因此,要从要从热力学和力学和动力学两方面来研究色力学两方面来研究色谱行行为。一、分配系数一、分配系数K K和分配比和分配比k k1 1分配系数分配系数K K 分配色分配色谱的分离是基于的分离是基于样品品组分在固定相和流分在固定相和流动相之相之间反复多次地分配反复多次地分配过程,而吸附色程,而吸附色谱的分离的分离是基于反复多次地吸附一脱附是基于反复多次地吸附一脱附过
17、程。程。这种分离种分离过程程经常用常用样品分子在两相品分子在两相间的分配来描述,而描述的分配来描述,而描述这种分配的参数称种分配的参数称为分配系数分配系数见它是指在一定温度和它是指在一定温度和压力下,力下,组分在固定相和流分在固定相和流动相之相之间分配达平衡分配达平衡时的的浓度之比度之比值,即,即 2.2.分配比分配比k k 分配比又称容量因子,它是指在一定温度分配比又称容量因子,它是指在一定温度和和压力下,力下,组分在两相分在两相间分配达平衡分配达平衡时,分配,分配在固定相和流在固定相和流动相中的相中的质量比。即量比。即 k k值越大,越大,说明明组分在固定相中的量越多,分在固定相中的量越多
18、,相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色子。它是衡量色谱柱柱对被分离被分离组分保留能力的重分保留能力的重要参数。要参数。k k值也决定于也决定于组分及固定相分及固定相热力学性力学性质。它不它不仅随柱温、柱随柱温、柱压变化而化而变化,而且化,而且还与流与流动相及固定相的体相及固定相的体积有关。有关。式式中中CsCs、CmCm分分别为组分分在在固固定定相相和和流流动相相的的浓度度;VmVm为柱柱中中流流动相相的的体体积,近近似似等等于于死死体体积。VsVs为柱柱中中固固定定相相的的体体积,在在各各种种不不同同的的类型型的的色色谱中中有有不
19、不同同的的含含义。例例如如:在在分分配配色色谱中中,VsVs表表示示固固定定液液的的体体积;在在尺尺寸寸排排阻阻色色谱中,中,则表示固定相的孔体表示固定相的孔体积。3.3.分配系数分配系数K K与分配比与分配比k k的关系的关系 其中其中称称为相比率,它是反映各种色相比率,它是反映各种色谱柱型特点柱型特点的又一个参数。例如,的又一个参数。例如,对填充柱,其填充柱,其值一般一般为6 63535;对毛毛细管柱,其管柱,其值为6060600600。二、塔板理二、塔板理论 最早由最早由MartinMartin等人提出塔板理等人提出塔板理论,把色,把色谱柱比作一个精柱比作一个精馏塔,沿用精塔,沿用精馏塔
20、中塔板的概塔中塔板的概念来描述念来描述组分在两相分在两相间的分配行的分配行为,同,同时引人引人理理论塔板数作塔板数作为衡量柱效率的指衡量柱效率的指标。该理理论假定:假定:(i i)在在柱柱内内一一小小段段长度度H H内内,组分分可可以以在在两两相相间迅迅速达到平衡。速达到平衡。这一小段柱一小段柱长称称为理理论塔板高度塔板高度H H。(iiii)以以气气相相色色谱为例例,载气气进入入色色谱柱柱不不是是连续进行行的的,而而是是脉脉动式式,每每次次进气气为一一个个塔塔板板体体积(VVm m)。)。(iiiiii)所所有有组分分开开始始时存存在在于于第第0 0号号塔塔板板上上,而而且且试样沿沿轴(纵)
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