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胚胎干细胞的研究进展

摘要：胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。已经广泛用于生命科学的许多领域，它在医学方面的应用成为医学领域的研究热点。本文综述了近些年关于胚胎干细胞分离培养与鉴定特征和应用的研究进展，同时也指出了目前所面临的问题，对今后的研究方向进行了展望。
关键词：胚胎干细胞；分离培养与鉴定特征；应用

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞( primordial germ cells，PGCs) 中经分离体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞，与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现永生，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内中外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生细胞组织分化基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景[1,2]。
20世纪末开始，ES细胞的研究就一直是生物医学领域的热点。美国《科学》杂志评出的上个世纪十大科学突破中，“干细胞研究与应用”名列榜首。ES细胞的研究还处于起步阶段，目前人们已经能够分离培养干细胞，但诱导ES细胞定向分化还面临许多困难。
1 胚胎干细胞的概念和研究历史
胚胎干细胞研究的起源来自20世纪70年代对畸胎瘤的研究：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠体内后产生了畸胎癌( 即恶性的畸胎瘤) ，畸胎癌内的细胞( 即EC，胚胎癌细胞) 能在体外自我更新且能分化成不同种类的细胞，由于这种类型的畸胎癌只能由着床前的早期小鼠胚胎产生，因此推测EC细胞的来源是胚胎发育早期短暂出现的外胚层细胞( epiblast) 关于EC细胞的研究使科学家认为可能从小鼠早期胚胎中分离到一种能分化成多种细胞的具有全能性的干细胞，即胚胎干细胞( ESC)。
ES细胞研究，首先源于畸胎瘤干细胞(teratocarcinoma stem cell)或胚胎瘤细胞(embryoniccarcinoma cell , EC细胞)。1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了EC细胞。1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman[3]用延缓着床的胚泡和美国加州大学旧金山分校的Martin用条件培养基分别成功地分离、体外培养了小鼠的ES，从此进入了胚胎干细胞培养建系的新纪元。此后，人们建立了许多动物的ES细胞系，1990年，Evans[4]、Strojek[5]各自成功地建立了猪类ES细胞系。1992年，Matsui[6]等用小鼠原始生殖细胞首先建成EC细胞系，又开创了一种新的建立全能性(或多能性)细胞系的材料。1994年，Robert[7]用牛原始生殖细胞建成EC细胞系，证明了原始生殖细胞可以作为建立全能性(或多能性)细胞系的新型材料。1995年Thomson[8]等从恒河猴的胚囊中分离、建立了ES细胞株，这是第一个建株的灵长类动物的ES。近年来，美国Wiscosin大学的Thomson和Hopkins大学的Gearhart分别用不同的方法成功的得到了几个人的ES细胞系，这一工作奠定了对人ES实验研究的基础。国内在细胞胚胎干方面的综合性研究虽然起步较晚(1989年) ，但发展非常迅速，在基础研究方面，尚克刚赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛惠珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在应用研究方面，窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团，中国军事医学科学院发现了人胚胎干细胞素，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果[9]。
2 胚胎干细胞的特征
2.1 胚胎干细胞的生物学特征
ES细胞显著区别于其他细胞：（1）ES细胞具有全能性，体外培养可诱导分化成机体的任何组织细胞类型。细胞全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白[10]；（2）ES细胞具有无限增殖性，体外培养能在未分化状态下无限增值；（3）ES细胞具有种系传递功能；（4）ES细胞易于进行基因改造操作；（5）ES细胞保留了正常二倍体的性质且核型正常；（6）ES细胞能参与胚胎各组织器官的生长发育，获得包括生殖系在内的后代；（7）ES细胞多数处在细胞周期的S期，缺少G1期检测点；（8）在雌性哺乳动物的每个体细胞内，2个X染色体中的一个会永久失活，X失活不发生于未分化的ES细胞[11,12]。
2.2 胚胎干细胞的形态学特征
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高，有一个或多个明显的核仁，核型正常，具有整倍性。在体外分化抑制性生长时，ES细胞呈克隆状生长，排列紧密，呈鸟巢集落状，难以看清细胞界限，集落边界清晰，有立体感 用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色，小鼠ES细胞的直径为7 ～ 18 m，猪牛羊ES细胞的颜色较深，直径为12 ～ 18m [13]。
3 胚胎干细胞的分离与培养
3.1 胚胎干细胞的建系
ES细胞建系，来自由分离的内细胞群细胞从5 ～ 9周的胚胎生殖腺中分离ES细胞，也用克隆技术将体细胞核移植到去核卵母细胞中，使之发育成囊胚， 再分离其内细胞群细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。Hwang等[14]应用这种方法获得了胚胎干细胞1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES细胞系，在此之后近20年里，人们相继自早期胚胎建立了仓鼠、猪、兔、水貂、大鼠、鱼类、鸟类、牛等灵长类动物( 恒河猴狨) 和人的类ES细胞系，从PGCs分离克隆到小鼠EG细胞系后，人们分别自PGCs分离克隆到人山羊鸡等类ES细胞[15]。
3.2 胚胎干细胞的体外培养
3.2.1培养基成分
需要特殊的培养液，由于胚胎干细胞来源于分裂增殖的早期胚胎细胞，营养要充足以维持其生长代谢。因此，需要含糖量高营养丰富的高糖型DMEM培养基以提供饲养细胞生长所需要的能量，同时又能提高胚胎干细胞的增殖速度。
3.2.2饲养层细胞
饲养层细胞能向培养液中分泌多种细胞因子提供胚胎干细胞生长的环境和信号，通过细胞接触机制和非接触机制，促进胚胎干细胞增殖并阻止其分化饲养层细胞的来源，可以是人或胚鼠的成纤维细胞。
3.2.3细胞因子
许多细胞因子有促进胚胎干细胞增殖和抑制其分化的作用，需要加入白血病抑制因子抑制分化。
4 胚胎干细胞的鉴定
4.1 形态学鉴定
胚胎干细胞的形态结构与早期胚胎细胞相似，细胞体积小，核质比高，细胞核显著，核内有一个或多个核仁，细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状。
4.2 生长特性鉴定
ES细胞在体外分化抑制培养时，有集群生长的趋势，呈集落状生长，细胞堆积密集，集落周边整齐，与饲养层界限分明且色泽深亮，有时会有单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。但不同物种、不同类型的ES细胞的特征又有所不同。 如小鼠ES细胞直径一般为12～14μm，ES细胞集落表面细胞层次分明，以环状形式排列，呈典型的“鸟巢状”；牛的为11～19μm，猪的为12～15μm，兔的为9～12μm，且它们的ES细胞集落呈“馒头状”。
4.3 免疫学鉴定法
碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)：许多研究表明，AKP的高表达与未分化的多能干细胞相关，如哺乳动物的桑葚胚和早期囊胚碱性磷酸酶呈阳性，并且在桑葚胚和胚泡细胞中均有AKP的表达，ES细胞中也都含有丰富的AKP，而在已分化的ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性，因此，可以鉴定ES细胞是否分化[16]。
5 胚胎干细胞的研究应用
5.1 胚胎干细胞在生物基础上的应用
5.1.1胚胎干细胞作为外源基因导入的重要受体细胞之一
随着功能基因组学研究的全面展开，利用胚胎干细胞建立转基因动物的研究热点在基因打靶上， 因为这种方法能够将外源基因导入靶细胞染色体上某一特定部位或使某一基因发生定点突变实现了外源基因的定点整合。
5.1.2胚胎干细胞用于人体发育的细胞和分子机制的研究
在哺乳动物中， 由于在胚胎发生的重要时期的细胞数量很少且细胞之间的关系极为复杂分析单个信号的作用十分困难。 胚胎干细胞体外培养定向诱导分化体系的建立避开了这些障碍，将十分复杂的问题简单化为细胞及细胞外分化调节因子， 提供一个相当对单纯的反应环境，大大方便了人们对细胞分化及胚胎发育的分子机制的研究。
5.1.3胚胎干细胞用于动物生理机能调控的研究
利用基因定位技术破坏相关基因， 可以制备甲状腺肾上腺卵巢胰腺功能紊乱的小鼠模型，以研究高血压和繁殖功能与下丘脑-垂体分泌激素调节的关系。利用基因定位技术可以研究肿瘤的形成过程， 转基因小鼠可用于研究肿瘤的形成过程近交系小鼠肿瘤发生过程的特异性， 表明肿瘤发生具有遗传性。利用基于定位技术研究激素与控制生物发育基因的关系，用细胞遗传操作技术增加或删除控制发育的基因制备基因缺失型小鼠， 观测这种小鼠的表现以及对有关激素作用的反应。
5.2 人类胚胎干细胞的临床应用
人类ES细胞的临床应用，既是将人类ES细胞进行一定程度的克隆，用于治愈疾病。而治疗性克隆，一直是世界上争议的话题，英国、日本、中国、韩国等支持治疗性克隆，认为这是社会的进步；而美国、德国等一直反对对人类胚胎进行的任何克隆。2010年10月，美国杰龙生物医药公司培植的GRNOPC1人类ES细胞已在佐治亚州亚特兰大“牧者中心”医院展开全球首宗人类胚胎干细胞治疗的人体临床试验，以评估GRNOPC1人体ES细胞用在治疗脊髓损伤方面的安全性与耐受性。2010年11月，美国食品和药物管理局（FDA）同意美国先进细胞技术公司可以实施使用闲置的试管婴儿的ES细胞治疗遗传性眼病的临床试验。2011年7月，该公司正式进行了首例以人类ES细胞医治渐进式失明患者的手术。早期迹象显示，患者在手术过程中适应良好。2011年9月，英国药品监管部门于批准美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司开展人类ES细胞试验。该公司今后将利用人类ES细胞就青少年失明展开临床试验。这是欧洲首次批准人类胚胎干细胞临床试验。
5.3 胚胎干细胞在生产上的应用
由于胚胎干细胞可以作为外源基因的受体， 所以人们可以利用它来生产一些携带有特殊功能基因的转基因动物。 生产转基因动物的方法有两种：①胚胎嵌合法将一定数量的转基因胚胎干细胞注射入囊胚或裸胚共同培养生成嵌合胚， 再将嵌合胚移植入同期发育的受体母畜子宫使其产下嵌合体动物，然后互相交配通过有性生殖生产纯合基因型转基因动物。 ②细胞核移植法以携带有外源基因的胚胎干细胞作核供体进行核移植生产转基因胚胎， 通过胚胎移植将转基因胚胎移植给受体母畜即可生产转基因动物， 转基因动物携带的外源基因在世代交替过程中能逐代传递。
6 目前存在的问题及展望
在ES细胞的研究中，仍然存在着许多问题，如诱导分化效率低定向细胞分离和纯化困难培养条件滞后定向分化的机制临床应用与转基因的安全性交叉污染免疫排斥等。除这些外，由于ESC涉及早期胚胎，因此由涉及的伦理社会法律医学神学和道德等争议也限制了当前hES细胞的发展，不得不引起重视[17]。
近年来的研究显示，体细胞在四个转录因子Oct-4 Klf-4Sox-2和c-Myc的作用下可以重编程为诱导多能干细胞( induced pluripotent stem cells，iPSC)，由于人iPSC 可以较容易地由个体自身的体细胞经诱导获得，同时避免伦理方面的问题，因此，iPSC 被认为是替代ESC的良好材料，为了提高iPS 细胞技术的效率及安全性，研究围绕着筛选标记载体系统转导基因的种类体细胞类型和一些可以促进效率提高的化合物筛选等展开，目前进展很快。
但是，iPS 细胞也存在许多谜团，如iPS 细胞其体细胞特异的基因是否完全沉默重编程的结果差异和危险性等[18]希望随着科技的发展，科学家们能陆续解答这些谜团，让ESC和iPS 更好的造福于人类。
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内容总结

（1）胚胎干细胞的研究进展

摘要：胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞