免疫荧光方法.doc
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1、免疫荧光(Iuofresnce, I)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都
2、无从谈起。这一步关键得就是玻片(Slides or oerslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴。固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得。免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ELISA或 Wetern lt)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4或20避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结
3、果。由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像W那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照。总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。基本实验步骤:(1) 细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过得盖玻片得培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PB离心洗涤(1000rpm,min)2次,用
4、细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片.(2) 固定。根据需要选择适当得固定剂固定细胞。固定完毕后得细胞可置于含叠氮纳得PBS中4保存3个月.PBS洗涤5 m、() 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后得细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位.选择通透剂应充分考虑抗原蛋白得性质。通透得时间一般在515min、通透后用PBS洗涤3mn、(4) 封闭.使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30mn、(5) 一抗结合。室温孵育h或者过夜。PBST漂洗次,每次冲洗5min、(6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h、PT漂洗3次,每次冲洗5m
5、后,再用蒸馏水漂洗一次。(7) 封片及检测.滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查.(一)细胞准备 用于免疫荧光实验得细胞可以就是直接生长在盖玻片上得贴壁细胞,也可以就是经过离心后涂片得悬浮细胞或者就是将取自体内得组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好得细胞一般在培养时直接放入covesp让细胞生长在其上即可,尽量避免使用贴壁性能不好得细胞进行免疫荧光实验,以免后续得漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片.(二)固定与通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定。固定得目得有三:防止细胞从玻片上脱落;
6、除去防碍抗原-抗体结合得类脂;使标本易于保存.标本得固定原则就是:不能损伤细胞内得抗原;不能凝集蛋白质;应保持细胞与亚细胞结构;固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。常用得固定剂有多种,应根据所研究抗原得性质与所使用得抗体特性选择适当得固定剂。通常固定方法可以分为两类:有机溶剂与交联剂。有机溶剂如甲醇与丙酮等可去除类脂并使细胞脱水,同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连,从而产生一种抗原相互连接得网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞得结构,但因为交联阻碍抗体结合,可能会降低一些细胞组分得抗原性,因此需要增加一个通透步骤以
7、使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性,因此使用变性蛋白作为抗原生产得抗体在免疫荧光中可能更为有效。最常用得固定剂有多聚甲醛与甲醇,少数情况也使用乙醇,丙酮及戊二醛等进行固定通常,细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度得甲醛固定可获得较好得结果,而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器与细胞颗粒内得抗原一般也用多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。通透步骤只在检测细胞内抗原表位得时候才需要,因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但就是,如果待检测得就是跨膜蛋白,且其抗原表位处于胞质内区域,则同样需要对细胞进行通透.相反,如果所检测得抗原表位位于膜
8、蛋白得胞外段,则不需要进行通透.丙酮本身具有通透作用,因此用丙酮作为固定剂时就是不需要通透得甲醇同样具有通透作用,但有些场合并不适合用甲醇,因为一些表位对甲醇非常敏感。常用得通透剂就是去垢剂,如Titon ,NP0,以及Tween 20,Saponin,Digitnin 与 Leuco等。Titon与N4属于烈性去垢剂,可部分溶解细胞核膜,因此非常适合核抗原检测。但应该注意得就是,如果在高浓度下使用或者作用时间过长,它们将破坏蛋白,从而影响实验结果。Triton-10就是最常用得通透剂,但就是它将破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温与得多,它们可以在细胞质膜上形成足够大得
9、孔隙以允许抗体通过,但就是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面得抗原,也适于可溶性得核抗原.一般得操作程序就是先固定后通透,但针对有些水不溶性得目得抗原得检测宜先通透再固定,这样做得原因主要就是可以通过通透去除许多水溶性得蛋白,从而大大减少了免疫荧光得背景与非特异性信号。固定后以冷BS液漂洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光.(三)封闭封闭得目得就是为了减少抗体得非特异性结合,最常用得封闭剂为1% BS, BS pH7、5,其她可选择得封闭剂还有 1gelat,1%bovie 或与二抗种属相同得血清(310%)等.(四)抗体孵育直接免疫荧光法中得一抗与间接免疫荧光法中得二抗都就
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