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免疫毒性试验得指导原则（草案）
本指导原则就是为了有助于药品安全性得正确评价，对申报药品审评时所做免疫毒性试验提供得标准实施方法。但就是。对于所有得药品进行完全一样得免疫毒性试验，有时也不尽合理，重要得就是：应根据对象药品得特性采用最适宜得试验方法。
[背景]
在清除细菌与病毒等外来病原体以及体内产生得癌细胞等，并维持生体正常得过程中，免疫系统起着重要得作用。免疫功能低下容易导致机会感染与产生肿瘤，这在免疫功能缺乏症与获得性免疫功能缺乏综合征（AIDS）得病例中就是人们所熟知得。对免疫系统得有害作用（免疫毒性）与其她毒性不同，与其说就是其直接对患者得生存带来威胁，不如说由外来病原体得侵袭与内在性癌细胞得发生时产生得免疫毒性更有害。
关于药品审评申报得非临床免疫毒性试验，虽然指出了其重要性，但就是，构成免疫系统得细胞组织及其相互作用就是复杂得，免疫功能得评价项目很多，除小鼠之外得试验动物，特别就是毒性试验中通常使用得大鼠，其免疫功能试验方法得评价尚未充分进行，这些都就是实情，而且免疫功能试验方法得设定较迟。然而，近十年间，包括国际性得共同研究，免疫毒性试验方法得评价取得了较大得进步，即便就是使用大鼠进行得免疫毒性试验，也进入了堪称充分而实用得阶段。
在本指导原则中，利用具有免疫毒性得诸多化学物质在反复给药毒性试验时与免疫毒性有关得检查项目中出现异常得现象，其原则就是，根据反复给药毒性试验得结果，在怀疑存在免疫毒性得场合下，进而再做免疫毒性试验。
免疫毒性包括抑制免疫功能、变态反应、自体免疫以及其她得免疫功能异常亢进等，但本指导原则并未将试验药物特异性得免疫反应（药物变态反应与药物特异性得自体免疫）作为研究对象。（注1）
根据本指导原则，在符合表1得某一项时，必须进行免疫毒性试验。生物制品及应用生物技术得药品不列入本指导原则得对象。
[指导原则得目得]
为了有效地进行药物免疫毒性得检查及其性质得研究，必须根据预测得免疫毒性选择最适宜得试验方法与拟定实验方案。本指导原则得目得就是提供进行非临床免疫毒性试验时可供参考得实验程序与检查项目得选择标准。
本指导原则中，作为检查免疫毒性得试验，就是在过去一直沿用反复给药毒性试验得基础上，增设第1阶段免疫毒性试验（第1阶段试验）及第2阶段免疫毒性试验（第2阶段试验）。包括与反复给药毒性试验相关得免疫毒性得检查项目与第1阶段试验得主要目得就是筛选药物，这些药物对免疫系统可能会显示出直接或间接得毒性。在第1阶段试验中可以同时了解对体液性免疫得影响；第2阶段试验得目得在于从质量上与数量上证明免疫毒性得大小程度。
关于免疫毒性试验得实施方法，其技术进步很快，可以预料：比本指导原则所记述得试验法更为优异得方法即将被开发。当着人们进行试验之际，在参考本指导原则得同时，还应经常获取新技术，努力改进检查方法。
[检查项目得选择]
本指导原则所列示得检查项目被认为就是最低限度得要求，根据试验药物得不同性质，可以考虑适当增加检查项目。
反复给药毒性试验得免疫毒性有关检查项目为脏器重量、血液检查（血液学检查及血液化验）以及组织病理学检查中与免疫系统有关得项目。同时，在反复给药得毒性试验中，建议增加末梢血液淋巴细胞亚群检查及脾脏免疫组织化验等项目（表2-1）。从反复给药毒性试验得免疫毒性有关检查项目及增加得检查项目中发现异常时（注2），才作免疫毒性试验。
免疫毒性试验分为2个阶段。第1阶段试验进行抗体生成得检查以及脾脏与胸腺脏器重量测定等检查（表2-2）。天然杀伤细胞（NK）活性得检查最好补充到第1阶段试验中。
第1阶段试验未见异常得时，可以不进行第2阶段试验。第1阶段试验出现异常时，结合反复给药毒性试验得结果后，进行包括适当检查项目（表2-3）在内得第2阶段试验。在第2阶段试验中，必须证明所列免疫毒性得性质，特别应弄清对受影响细胞与免疫功能鉴别得影响强度，这就是尤为重要！。
反复给药毒性试验中，断定出现明确得免疫毒性，并从其毒性性质而言进行第1阶段试验得必要性很小时（注3），可直接进行第2阶段试验。
为了讨论免疫毒性得可逆行，根据需要可对发现异常得项目进行恢复性试验。
[试验实施得时期]
通常第1阶段试验在反复给药毒性试验之后进行，若有可能，也可以与反复给药毒性试验同时进行。第1阶段试验，原则上应在临床试验开始以前进行；第2阶段试验，根据需要可在适宜得时期内进行。
[试验方案]
第1阶段试验得试验方案应遵照以下条件，需要进行第2阶段试验得场合，应当制定与其目得最相宜得实验方案。
1、 动物种类、性别及周龄：最好使用与反复给药毒性试验得免疫毒性有关检查项目及增加得检查项目中发现异常得动物为同一物种、相同种系、一样得性别与周龄得动物（注4）。反复给药毒性试验中未见雌雄差异时，可以使用雌雄中得任意一种动物（注5）。
2、 动物数量：每组不少于8只，应当设定为在统计学具有足够数量得动物数。各组动物得分配采用随机分组法。
3、 给药途径：原则上为临床应用得给药途径。
4、 剂量等级：原则上应当设定不低于3种剂量得给药组，并另设对照组。参照反复给药毒性试验得免疫毒性有关检查项目及增加得检查项目中发现异常时得剂量，设定剂量得等级（注6）。
5、 对照组：设置仅用溶剂得阴性对照组。根据需要可以考虑增加正常对照组（注7）及阳性对照组（注8）。
6、 给药期间：原则上采用反复给药毒性试验为基准得给药期间。通常每周给药7次。
7、 观察等：进行一般症状得观察及体重测定。
[与免疫毒性有关得检查项目]
在反复给药毒性试验及免疫毒性试验中，作为研究对象得免疫毒性有关检查项目见表-2。根据试验药物得性质及试验得目得，可从这些检查项目中选择需要得项目，制定切实可行得试验方案。
[注释]
注1：关于迟发型药物变态反应，皮肤过敏试验得指导原则已经制定，但就是速发型药物变态反应得能够很好预测得试验方法迄今尚未建立。
注2：表-1第1项（1）得内容就是指怀疑出现免疫毒性得场合。所谓免疫毒性有关检查得异常就是指在该项检查中给药组与阴性对照组之间存在统计学意义得明显差异，但应考虑试验动物得标准数据等得范围及其变化。
注3：例如，仅仅发现嗜中性白细胞减少，未见其她异常得场合等。
注4：通常使用小鼠及大鼠。
注5：在同一笼子中饲养多只雄性动物时，应当考虑笼子得大小，使之不会发生打斗等饲养方面得问题。
注6：高剂量组就是将与对照组比较体重抑制不超过10%得用药量作为本组得剂量。设计剂量时必须做到：高剂量组应出现足够多得异常，而低高剂量组不应发生异常，希望得出给药剂量与动物反应得某种关系。高剂量组异常得变化很小，明确知道无须使用3种等级得剂量时，也可以使用2种剂量得给药组。
注7：通常没有必要，但就是所用溶剂对免疫毒性试验产生影响时，必须设置正常对照组。
注8：设置阳性对照组得目得在于评价检查手段就是否妥当。如果采用了另一种方法进行试验，即：使用少量动物观察给予环磷酰胺等阳性对照药物后得影响，则可省去该阳性对照组。
[参考文献]
1）、种种の试验法にして，Methods in Immunotoxicology Vols、 1 and 2( ed、 by Burleson, G、 R、 ,et、 al、 ); Environmental Health Griteria 180、Principles and Methods for Assessing Direct Immunotoxicity Associated with Exposure to Ghemical、pp、164_225 (1996); ImmunoTox Letter、 （日本免疫毒性学会发行） に揭载の免疫毒性试验プロトコ-ル等を参照すること。
表-1本指导原则中免疫毒性试验得对象药物
1．依据下述（1）至（3）得任意一项，均被怀疑为试验药物存在免疫毒性时：
（1）该品反复给药毒性试验及其她毒性试验得结果；
（2）与具有免疫毒性得已知药物得化学结构相似；
（3）其她情况。
2、 试验药物得临床应用符合于下列（1）至（2）得场合（注1）：
（1）免疫功能缺失症；
（2）与具有免疫抑制作用得药物（注2）联合用药。

注1：具有合理理由时，可从试验对象中排除。
注2：免疫抑制剂、抗癌药物、抗变态反应药物及甾体化合物等中具有免疫抑制作用得药物。
表-2免疫毒性得有关检查项目
Ⅰ、 反复给药毒性试验得检查项目
1、 一般状态及体重；
2、 血液学检查：免疫毒性得有关检查必须进行血细胞计数与测定白细胞得分类百分率。
3, 血液化验：免疫毒性得有关检查必须测定白蛋白/球蛋白比率（A/G）。
4、 脏器重量：免疫毒性得有关检查必须测定脾脏、胸腺及肾上腺得重量。
5、 组织病理学检查：免疫毒性得有关检查必须进行脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、肠道（包括淋巴集结）、肝脏、肾脏、肾上腺及皮肤得检查。
6、 最好增加末梢血液淋巴细胞亚群检查及脾脏免疫组织化验等项目。

Ⅱ、 第1阶段免疫毒性试验得检查项目
1、 抗体得生成：在给药过程中得适宜时期，使用羊得红细胞等T淋巴细胞依赖性抗原进行免疫。将羊得红细胞作为抗原使用，在空斑形成细胞（PFC）测定时，4天前测定血清得抗体值，6—7天前进行免疫。由羊得红细胞进行免疫采用静脉内给药。测定空斑形成细胞（PFC），最后一次给予试验药物得第2天，制作每只动物得脾脏细胞，并进行测定。测定血清抗体时，最后一次给予试验药物得第2天，采集每只动物得血液，制作血清，一直保存到

测定之时（根据需要可以冷冻）。抗体得测定采用酶标记免疫吸附测定法（ELISA）。
2、 用于抗体生成检查得试验动物，应进行一般状态、体重、脾脏重量、胸腺重量以及其她一些特殊需要得项目进行检查。
3、 根据需要，可以进行天然杀伤细胞（NK）得检查。为了进行天然杀伤细胞（NK）得检查，与抗体生成得检查不同，必须设置给药组及对照组。最后一次给予试验药物得第2天，制作脾脏细胞，使用适宜得标记细胞进行测定。

Ⅲ、 Ⅱ、 第2阶段免疫毒性试验得检查项目
1、 骨髓细胞得分类百分率：使用后肢骨骼。
2、 淋巴细胞亚群得检查：对于末梢血液以及脾脏得B淋巴细胞、T淋巴细胞、
T淋巴细胞亚群与天然杀伤细胞（NK），使用对于适宜表面标记等具有特异性得抗体进行计数，并求出其组成比。也可以用流式细胞测量法进行检查。
3、 血液化验：进行血清蛋白质得电泳。
4、免疫球蛋白得分类检查：最后一次给予试验药物得第2天，采集血样，制作血清，保存（根据需要可以冷冻）。采用酶标记免疫吸附测定法（ELISA）进行免疫球蛋白得分类（（IgM、IgG、IgA与IgE））水平得测定
5、 免疫组织得化验：对淋巴组织、肾脏（包括免疫复合物沉着）以及皮肤等得免疫组织进行化验。
6, 免疫功能得检查：
（1）抗体生成得检查：见上所述。
（2）天然杀伤细胞（NK）活性得检查：如上所述。
（3）其她免疫功能得检查：可以适当增加由Mitogene等引起得淋巴细胞增殖反应、细胞障碍性T细胞得活性、血清补体、细胞因子得生长、巨噬细胞与多态型白细胞得吞噬活性、迟延型变态反应（注1）、宿主抗性、淋巴结反应（注1、注2）、瞬时型变态反应（注1）、自体抗体、尿蛋白以及其她得检查。

（注1）将这些变态反应用作指标，讨论其抑制与亢进。
（2）有时将自体免疫得激发活性作为指标。
免疫毒性试验得工作程序
（此为用于说明得概述性参考资料，准确内容请见指导原则得原文）
新型候补药物

生物制品及应用生物技术得药品除外
反复给药得毒性试验（表2-Ⅰ）
脏器重量、血液检查及组织病理学检查
增加末梢血液淋巴细胞亚群得检查以及脾脏免疫组织得化验

（注1）
异常情况

第1阶段试验得免疫毒性试验（表2-Ⅱ）
抗体生成
脏器重量及其她必要得检测项目
[任选项：天然杀伤细胞（NK）得活性]
（注2）
异常情况

第2阶段试验得免疫毒性试验）
（表2-Ⅲ得适宜试验系统）
（注1）除去表-1第1项，表-1中得有关药物。
（注2）断定反复给药毒性试验得免疫毒性有关检查项目与增加得检查项目明显出现异常，而且进行抗体生成试验得必要性很小得场合下，可以直接进行第2阶段试验。
田生云译