免疫组化原理和步骤.doc
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1、免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程 一、实验原理与意义 免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二、实验器材 微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等。 三、试剂配制 1、 0、01 M PBS(pH 7、34 ):9、0 g Na
2、Cl + 50 ml 0、2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0、2M PB (pH 7、4)5、93 g NaH 2 PO 4 2H 2 O58、02 g Na 2 HPO 4 12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或190 ml A + 810 ml B(A、 0、2 M NaH 2 PO 4 2H 2 O:15、6 g in 500 ml ddH 2 O;B、 0、2 M Na 2 HPO 4 12H 2 O:71、632 g in 1000 ml dH 2 O)。 2、 Citrate Buffered Saline(0、01 M 柠檬酸缓冲液,PH6、0)
3、:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A、Citrate acid(柠檬酸):10、5 g 加双蒸水至 1000 ml;B、Citrate sodium(柠檬酸钠):29、41 g 加双蒸水至 1000 ml)。 3、 细胞通透液:由终浓度分别为 0、3%双氧水与 0、3%Triton X100 混合而成。配制方法就是先用微波加热得 36 ml PBS,再接着加 120 ul TritonX100,并加热一儿,冷却至临用前加 0、4 ml 30H 2 O 2 。 4、 5羊血清或封闭血清,用 PBS 稀释。 5、 含 0、03H 2 O 2 得 0、05DAB
4、(避光):用 20DAB(1,10 mg/ml)5 ul0、1 ul 30% H 2 O 2 95 ul PBS。 6、 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7、 Xylene、梯度 Ethanol(1002、95、80、70、50)、双蒸水、中性树胶(封裱剂)。 8、 苏木精染液: 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 1) 60 20 minXylene 2 10 minutes; 2) 100% absolute ethanol:2 5 minutes; 3) 95% ethanol 2 minutes; 4) 80% ethanol 2 minutes; 5) 70% ethanol 2 min
5、utes; 6) distilled water:5 min; 7) PBS 洗 3 次3 min。 2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 8) 用封闭通透液浸润切片 30 min(RT 避光)。配法就是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX100 加热几分钟后,临用前加 400 ul 30H 2 O 2 。 9) PBS 溶液洗 3 次3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 10) 切片放入 0、01 M 柠檬酸钠缓冲溶液(pH6、0)后,在微波炉里高火 4 min 至沸腾后,再加热约 6 min4 次,每次间隔补足液体,防止干片。 4、封闭非特异性蛋白 11) PBS
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