花生四烯酸产生菌高山被孢霉的高糖驯化研究.pdf
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1、微生物学通报 MAY 20,2012,39(5):645 653 Microbiology China 2012 by Institute of Microbiology,CAS 基金项目:福建省科技厅重大专项项目(No.2010NZ0001-4);国家自然科学基金项目(No.31071488)*通讯作者:Tel:86-592-2186038;: 收稿日期:2012-02-16;接受日期:2012-03-01 研究报告 花生四烯酸产生菌高山被孢霉的高糖驯化研究 曾思钰 凌雪萍 张长杰 卢英华*(厦门大学 化学化工学院 福建 厦门 361005)摘 要:【目的】提高花生四烯酸(Arachidon
2、ic acid,ARA)产量,克服 ARA 产生菌高山被孢霉(Mortierella alpina)在长期的保存及使用过程中易受到外界条件影响发生退化,从而导致菌种耗糖量降低、影响菌种摄入营养的能力和不利于工业化生产的缺点。【方法】首先采用固体培养基驯化,将菌种逐级涂布于梯度高糖 PDA 平板(含糖量分别为 2%、5%、7%、10%和 15%)培养,挑选经固体驯化后能耐受 10%高糖浓度平板的菌种,转接到两种含不同氮源的梯度高糖(含糖量分别为 3%、4%、5%和 6%)液体培养基中进行驯化,最后对驯化后的菌种进行 2 L 发酵罐放大实验。【结果】当培养基中以酵母粉为氮源时,驯化后菌体的最高耗糖
3、量由 3 g/(Ld)提高到 12 g/(Ld);当培养基中以玉米浆为氮源时,驯化后菌体的最高耗糖量由 7 g/(Ld)提高到 12 g/(Ld)。摇瓶驯化实验结果表明以玉米浆为氮源驯化的菌种发酵效果较好,发酵罐实验结果显示菌体生物量为 50 g/L,总油脂为 18 g/L,目的产物 ARA 产量为 8 g/L。相比未驯化之前的发酵结果,生物量和总油脂含量提高了近3 倍,ARA 产量提高了近 4 倍。【结论】经过高糖驯化,菌种的耗糖能力得到提高,生物量、总油脂及 ARA 的产量也都有所增加,从而可以使菌种在保存和使用过程中不易退化,保持稳定。关键词:花生四烯酸,高山被孢霉,高糖驯化 Domes
4、tication of the high-sugar-tolerant Mortierella alpina on arachidonic acid(ARA)production ZENG Si-Yu LING Xue-Ping ZHANG Chang-Jie LU Ying-Hua*(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen,Fujian 361005,China)646 微生物学通报 2012,Vol.39,No.5 http:/ Abstract:Objective In order to
5、 improve arachidonia acid(ARA)production,and prevent the degeneration of ARA-producing strain Mortierella alpina in long-term culture preservation and cultivation,which could lead to low consumption rate of substrates like carbon source.Methods Mortierella alpina strain was first domesticated in hig
6、h-sugar PDA plate with gra-dient sugar content(2%、5%、7%、10%and 15%).The strain which grew better in the solid medium containing 10%sugar was then selected and transferred to two liquid high-sugar me-dia with different nitrogen sources to domesticate.The gradient sugar contents were 3%、4%、5%and 6%,re
7、spectivlely.Finally,the domesticated strain was used to produce ARA in a 2 L bioreactor.Results The experimental results show that the consumption of sugar increased from 3 g/(Ld)up to 12 g/(Ld)in the medium with yeast extract,and from 7 g/(Ld)up to 12 g/(Ld)in the medium with corn steep liquor.Afte
8、r cultivation for 144 h in a 2 L bioreactor,the yield of ARA reached 8 g/L,which was 4 times higher than that obtained with the original strain.Conclusion The domestication of the high-sugar-tolerant Mortierella alpina increased the consumption of sugar,biomass,total fatty acid and ARA production.Th
9、e domesticated strain could maintain the high sugar resistance in the preserving process and turn to be more stable.Keywords:Arachidonic acid,Mortierella alpina,Domestication of the high-sugar-tolerant 花生四烯酸(Arachidonic acid,简称 ARA)即全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸,属于高级不饱和脂肪酸。由于其第 1 个双键起始于甲基端第 6个碳原子,故属于-6 系列多不饱
10、和脂肪酸1。ARA 不能由人体自身合成,它与亚油酸、亚麻酸一起被称为人体的必需脂肪酸2。ARA 是人体前列腺素合成的重要前体物质,研究表明,它具有增加血管弹性和提高免疫力等一系列生理活性,在促进婴幼儿大脑发育、预防心脑血管疾病以及化妆品、保健品领域都有较好的作用34。传统 ARA 主要来自于动物肝脏和鱼油等材料,由于受到原料来源等条件的限制,产量很低。利用微生物发酵生产 ARA,由于具有不受原材料、场地及外界条件限制、发酵条件比较容易控制、油脂脂肪酸组成比较简单和油脂产量高等优势,越来越受到研究者的重视5。目前生产ARA 的微生物主要有被孢霉、微藻和油脂酵母。其中,利用被孢霉生产具有细胞生长繁
11、殖快、发酵周期短、ARA 含量高和脂肪酸组成简单等优点,较适宜大规模发酵培养,因此,生产中一般都采用被孢霉来发酵获得 ARA6。近几年,研究者在实验过程中发现,被孢霉菌种易受到外界条件的影响发生退化,进而导致菌种耗糖能力降低、长势减弱和易染菌等现象56,其中菌种耗糖能力的降低直接影响到菌种摄入营养的能力,从而使得细胞生物量、油脂含量和ARA 的产量随之降低,对发酵过程产生非常不利的影响。为了得到高发酵性能的菌株,本实验拟以高山被孢霉为研究材料,对其进行高糖驯化研究,以期提高其耗糖能力,从而提高菌种生产ARA的能力,为工业化发酵生产ARA奠定基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.
12、1 菌种:高山被孢霉(Mortierella alpina),厦门大学生物化工研究所保存。1.1.2 培养基:固体培养基(PDA,g/L):马铃薯200,葡萄糖 20,琼脂 20。种子培养基(g/L):葡萄糖 30,酵母粉 4,KH2PO4 2.5,MgSO47H2O 0.3,pH 6。曾思钰等:花生四烯酸产生菌高山被孢霉的高糖驯化研究 647 http:/ 发酵培养基(g/L):葡萄糖60,MgSO47H2O 0.1,KH2PO4 0.5,CaCO3 0.05,ZnSO47H2O 0.1,1 mL/L 混合维生素(维生素 B12 500 g/L,生物素 VH 500 g/L,维生素 B1 1
13、00 mg/L,泛酸钙120 mg/L),1 mL/L 混合微量元素(FeCl36H2O 0.2 g,H3BO3 6.5 g,MnCl24H2O 0.8 g,CoCl26H2O 0.005 g,CuSO45H2O 0.002 g,NiSO46H2O 0.05 g,溶于1 L 水,调 pH 至 7),1105 Pa 灭菌 30 min。1.2 实验方法 1.2.1 生物量的测定:干重法。将发酵液抽滤,并用去离子水洗涤 3 次,于 60 C 烘箱烘干至恒重(含水量小于 4%),称得干重。1.2.2 总油脂(Total fatty acid,TFA)的提取:有机溶剂提取法。将干菌体研磨粉碎,用正己烷
14、萃取,旋转蒸发除去有机溶剂至恒重,得到粗油。1.2.3 ARA 的测定:(1)ARA 甲酯化:三氟化硼乙醚催化法7。将一定量的油脂(约 0.1 g)和适量的内标物(本实验使用二十二碳六烯酸-DHA),置于 50 mL 磨口锥形瓶中,加入 5 mL 的 0.5 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液于 60 C 恒温水浴回流10 min,加入 5 mL 30%的三氟化硼乙醚-甲醇溶液于 60 C 恒温水浴反应 30 min,冷却后加入5 mL 正己烷振荡,加 1 mL 饱和氯化钠溶液,静置分层,加入少量无水硫酸钠脱水,取上层正己烷相,有机滤膜过滤,待检测。(2)ARA 检测方法:气相色谱分析法。检测条件
15、如下:安捷伦气相色谱分析仪,HP-88 柱;初始柱温 140 C,检测器温度 250 C,柱箱温度250 C,载气氮气;升温程序:初始温度 140 C,维持2 min,之后以每分钟上升10 C的速度提高温度至 230 C,维持 5 min。采用马泰克公司生产纯度高于99%的DHA(二十二碳六烯酸)为内标物。1.2.4 葡萄糖浓度的测定:DNS(二硝基水杨酸)法8。DNS 在碱性条件下,与还原糖共热后被还原成棕色氨基化合物,在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色深浅成比例关系。1.2.5 高山被孢霉的高糖驯化:方法一(固体培养基驯化):将菌种涂布于梯度高糖 PDA 平板(含糖量分别为 2%、5%
16、、7%、10%和 15%),于 28 C恒温箱培养 56 d,挑选高糖平板上长势良好的菌株,进行发酵培养检验并保存菌种。方法二(液体培养基驯化):挑选经方法一驯化后能耐受 10%高糖浓度平板的菌种转接到两种含不同氮源的梯度高糖发酵液体培养基中进行摇瓶培养(含糖量分别为 3%、4%、5%和 6%),于 28 C、150 r/min摇床培养 6 d,期间每隔 24 h 取样 5 mL,测菌体生物量、总油脂、ARA 含量及发酵液的残糖量。2 结果结果 2.1 固体培养基的高糖驯化 在固体培养基驯化实验过程中发现,随着含糖量的增加,菌体生长逐渐趋于缓慢,长满平板的时间延长,菌种未驯化前接入 10%的高
17、糖平板的生长情况如图 1A 所示,菌落形成面积小、边缘不规则、生长缓慢,培养 15 d 仍无法长满平板;经过梯度糖浓度平板的逐级驯化培养和多次的循环转接实验,菌种对糖的耐受力逐渐增强,经驯化后的菌种在10%的高糖平板上的生长情况如图 1B 所示,驯化后的菌落形成面积明显增大、边缘规则,从平板背面观察菌体较驯化之前颜色偏黄,培养5 d左右长满平板,而对含糖量为15%的高糖平板耐受力还不足,无法长满平板,因此本实验最终选择 10%的含糖量为高糖平板驯化浓度。由此可以看出,通过固体培养基高糖驯化获得的菌株,对高糖的耐受能力有所增强,直接表现为生长速度加快,长满平板的时间缩短。通过后期摇瓶发酵检验,该
18、菌种产油能力也有所提高,从中挑选长势良好的菌种保藏。2.2 液体培养基的高糖驯化 糖的浓度对菌体的生长有一定的影响,经过648 微生物学通报 2012,Vol.39,No.5 http:/ 逐级提高培养基中的糖浓度,高山被孢霉对糖的耐受能力也逐渐增强。利用 2.1 中方法驯化得到的耐受 10%高糖平板的菌种,在液体培养基驯化的实验过程中发现,不同氮源培养基对菌体生长和 ARA 的产量有较大的影响,因此接下来的实验分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行液体发酵驯化实验。2.2.1 以酵母粉为氮源的驯化结果:3%含糖量的摇瓶培养,微生物在此条件下生长缓慢(图略),生物量在 120 h 达到最大值 12 g
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