产肠毒素性大肠杆菌致病特性及益生菌的筛选与疾病控制研究.pdf
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1、 学校编码:学校编码:10384 分类号_密级 分类号_密级 学号:学号:200326051 UDC UDC 硕 士 学 位 论 文硕 士 学 位 论 文 产肠毒素性大肠杆菌致病特性 及益生菌的筛选与疾病控制研究 产肠毒素性大肠杆菌致病特性 及益生菌的筛选与疾病控制研究 The Research of Pathogenetic Characteristics of Enterotoxigenic Escherichia coli and The Screening and Inhibitory Effect of Probiotic on Pathogenic Bacteria 朱 红 梅 指
2、导教师姓名:周 涵 韬 副教授 专 业 名 称:发 育 生 物 学 论文提交日期:2006 年 6 月 论文答辩时间:2006 年 8 月 学位授予日期:2006 年 9 月 答辩委员会主席:刘波 评 阅 人:2006 年 7 月 厦门大学学位论文原创性声明厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文,是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果,均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人(签名):年 月 日 厦门大学学位论文著作权使用声明厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦
3、门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅,有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索,有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。本学位论文属于 1、保密(),在 年解密后适用本授权书。2、不保密()(请在以上相应括号内打“”)作者签名:日期:年 月 日 导师签名:日期:年 月 日 摘 要-I-摘 要 摘 要 产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli.,ETEC)是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊)腹泻的重要病原菌,初生幼畜
4、被ETEC感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,给养殖业带来严重的经济损失。目前,通过在饲料中添加抗生素进行防治是一条最主要的途径。但近些年来,抗生素的由于耐药性、安全性等问题遭到了广泛的置疑和反对,世界上很多国家都对饲料中添加抗生素实行了禁用或限用。益生素(Probiotics)由于“无毒”、“无抗药性”、“无残留”、“无副作用”的特点,逐渐成为国内外饲料添加剂研究的热点。本文利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)标记技术研究ETEC致病特性及筛选益生菌在体内、体外进行抑制致病菌研究,主要结果如下:1通过电击转化法,将带有gfp标记基
5、因的pGLO质粒成功转化到产肠毒素性大肠杆菌K88中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现标记菌株发出绿色荧光。进一步通过分子鉴定、脂肪酸分析、血清学鉴定发现标记菌株和原始菌株没有差异。同时研究在不同微生物学培养条件如:温度、pH值、盐浓度培养条件下,标记菌株的生长状态和原始菌株一致。2建立小白鼠K88、K88-GFP攻毒模型,K88的LD50为5.53108 CFU/mL,K88-GFP的LD50为4.86108 CFU/mL。同时利用标记菌株自发荧光的特点研究感染K88-GFP小白鼠的各器官致病菌的定植情况,发现在肝、肾中细菌最多,同时在脑、肌肉中也有少量分布。并且分析感染K88的小白鼠的血
6、液成分、血生化指标的变化。K88对白细胞及相关指标的影响较大,WBC、W-SCC、W-LCC显著降低;对红细胞及相关指标的影响较小,仅在6h RBC、HCT、HGB降低;对血小板也有影响,PLT显著下降,MPV有所升高。K88对血液生化指标中反应肝、肾功能的指标影响较大,ALT、AST和BUN、UA显著升高,而对反应脂代谢的指标无影响,TCHO、TG与对照组相比无差异。3从土壤中筛选到的一株芽孢杆菌对K88、鸡大肠杆菌、沙门氏菌有抑制作用,通过对其表型特征、生理生化特征、脂肪酸分析和16S rDNA序列分析的多相分类研究,初步确定该菌株为短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。
7、摘 要-II-4在研究发酵动态对PB JK-2体外抑制K88、K88-GFP的影响时发现,30、pH值7.5、发酵24h的原液,同时接入PB JK-2的抑菌效果最好。在对感染K88-GFP的小白鼠模型的疾病控制研究时发现,腹腔注射PB JK-2的小白鼠LD50是不添加PB JK-2的对照组LD50的1.34倍,延缓了小白鼠的死亡,具有一定的保护作用。由此可见,短芽孢杆菌PB JK-2在体内、体外都能对K88起到抑制作用。本文表明利用GFP标记技术可以方便地检测K88-GFP在小白鼠体内的各器官定植及致病情况,为研究ETEC致病特性提供一种有效工具。研究表明致病菌可能具有侵袭性可以感染多种器官,
8、感染的小白鼠血液组分中红细胞、白细胞及相关指标降低,与对照组有显著差异并且通过对血液生化指标研究发现对肝、肾功能有严重损坏。同时,从土壤中筛选到一株短芽孢杆菌PB JK-2,研究发现对K88体内、外都有抑制作用,这对开发益生菌新品种、了解益生素与致病菌的互作机理有具有重要的理论和实践意义。关键词:关键词:产肠毒素性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;益生素。目 录-III-Abstract Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)is one of the most important pathogenic bacteria in human and animals(p
9、ostweaning piglets,calves,lambs).Neonatal animals often die from diarrhea and dehydration after infected ETEC.The diarrhea is responsible for economic losses due to mortality,morbidity,decreased growth rate,and cost of medication.At present,the effective way to treat this disease is to add antibioti
10、cs to the feed,but it is controversial and averse because of the problem of the bacteria with resistance to antibiotics.Many countries have forbidden or restricted the use of antibiotics and side-effect.Probiotic is frequently and successfully adopted to add to the feed because it is nontoxic,no res
11、istance,no residue and no side-effect.This paper includes application for Green fluorescent protein(GFP)in the research of pathogenesis of ETEC and the screening and inhibitory effect of probiotic on pathogenic bacteria.The mainly results of the research are as follows:1.The plasmid pGLO with green
12、fluorescent protein gene was transformed successfully to enterotoxigenic Escherichia coli strain K88 by electroshock.It could be observed that the GFP expressed stably and efficiently in transformant by the detection of ultraviolet radiating and fluorescent microscope.By detection of PCR amplificati
13、on of a structural gene in flagellum,the analysis of fatty acid and serological identification,the transformant and the wild-type strains were proved to have the same genetic background.Meanwhile the transformant was not impaired in their ability to grow under different ferment conditions such as di
14、fferent temperature,pH and salt concentration of culture media,compared with the wild-type strain.2.The mice model was established by challenged K88 and K88-GFP.In the model,LD50(median lethal dose)of K88 was 5.53108 CFU/mL,LD50 of K88-GFP was 4.86108 CFU/mL.Fluorescence provided a convenient way fo
15、r the study of adherence and colonization in organs of mice.A large number of K88-GFP bacteria were discovered in liver and kidney,whereas only rare bacteria were obtained from on 目 录-IV-brain,muscle.The component and biochemical substances in serum also changed in infected mice.Influence from K88-G
16、FP infection on WBC and a series of indexes was significant and the value of WBC、W-SCC、W-LCC was depressed seriously.RBC and a series of indexes were not affected apparently and the value of RBC、HCT、HGB only reduced at 6 hours compared with healthy mice.Also variance of the PLT and a series of index
17、es between infected mice and healthy was great,and the PLT value decreased greatly while the PLT value increased.ALT、AST which was the index standing for the function of liver and BUN、UA which was the index standing for the function of kidney increased observably,but no significant difference of TCH
18、O、TG which was the index standing for the fat metabolism was observed.3.A Brevibacillus strain was isolated from soil which had an inhibitory effect on ETEC strain K88,Escherichia coli strain from chicken and Salmonella sp.A ployphasic taxonomy study including its morphology,physiological and bioche
19、mical characteristics,the analysis of fatty acid and 16S rDNA sequence was performed on the isolate,which showed that the strain represented as Brevibacillus brevis.4.The experiment showed that the optimal inhibitory effect was obtained when PB JK-2 was cultivated at 30 and the pH7 of medium for 24
20、hours and cultivated with pathogenic bacteria at the same time.PB JK-2 also increased the LD50 of the mice model of K88-GFP and leaved death of mice,so it suggested a probability of the protection mice from the infection with pathogenic bacteria.This study indicated that GFP as a novel fluorescent m
21、arker had a potential and convenient use in the research of colonization of pathogenic bacteria.K88 may be invasive and could colonize many organs and it impaired the function of liver and kidney seriously.The strain isolated from soil had an antagonistic effect on pathogenic bacteria in vivo and in
22、 vitro.It generates a prospect for the exploitation of probiotic and the antagonistic mechanism between pathogenic bacteria and probiotic.Key words:Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC);Green fluorescent protein(GFP);Probiotics.目 录-V-目目 录录 1 前言前言 1 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况 1.2 绿色荧光蛋白研究综述 1.3 益生素研究综述 1.4
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