酱肉发酵菌种的筛选及发酵工艺优化.pdf

食 品 与 发 醇 科 技 F o o d a n dF e r me n t at i on T e c h n ol o g y 第 4 6卷(第 2期)V o 1 4 6，N o 2 酱肉发酵菌种的筛选及发酵工艺优化 邹 忠义，贺稚非，李洪军，邹程焓，周芳(西南大学食品科学学 院，重庆4 0 0 7 1 6)摘 要：为优化传统酱 肉自然发酵工 艺，通过 对6 株 标准乳酸 茵和6 株 标准酵母 菌的发酵特性研 究，筛选 出乳酸 茵L 3 与 酵母茵Y5 作为混合发酵茵种，通过发酵工艺正交试验，得到酱 肉加工 中最佳发 酵工艺参数 为：酵母 茵Y 5 与乳酸 茵L 3 比例为1：4，接种量为2，3 0 9 C 发酵 时间为4 8 h，葡萄糖添加量为0 2。关键词：酱肉；发酵菌种；工艺优化 中图分类号：T S 2 0 1 3 文献标识码：A 文章编 号：1 6 7 4-5 0 6 X(2 0 1 0)0 2 0 0 6 4 0 0 0 5 S c r e e n i n g o f S o y c u r e d P o r k Fe r me n t a t i o n S t r a i n s a n d Op t i mi z i n g t he Pr o c e s s o f Fe r me n t a t i o n Z O U Z h o n g-y i，H E Z h i-f e i，U H o n g-j u n ，Z O U C h e n g h a n，Z H O U F a n g (C o l l e g e o fF o o d S c i e n c e，S o u t h w e s t U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g 4 0 0 7 1 6,C h i n a)Ab s t r a c t：I n o r d e r t o o p t i mi z e t h e p r o c e s s o f n a t u r a l f e r me n t a t i o n o f t r a d i t i o n a l s o y c u r e d p o r k，t h e p a p e r s t u d i e d t h e s tr a i n s o f f e rm e n t i n g s o y c u r e d p o r k a n d t h e p r o c e s s o f f e rm e n t a t i o n Ac c o r d i n g t o t h e f e rm e n t i n g p r o p e r t y o f 6 s t a n d a r d L a c t o b a c i l l U S a n d 6 s t a n d a r d y e a s t s h e s t r a i n s o f L 3 a n d Y 5 w e r e s c r e e n e d a s mi x e d s t a r t e r c u l t u r e s T h e r e s u l t o f o rt h o g o n a l e x p e r i me n t s h o we d t h a t the o p t i mal p a r a me t e r s o f f e r me n tat i o n we r e a s f o l l o ws：t h e p rop o rt i o n o f Y5 a n d L 3 w a s 1：4，t h e a mo u n t o f i n o c u l a t i o n wa s 2，t h e t i me o f f e r me n t a t i o n w a s 4 8 h i n 3 0 o C，a n d t h e a d d i t i o n o f g l u c o s e wa s 0 2 Ke y wo r d s：s o y c u r e d p o r k；t h e s t r a i n s o f f e rm e n t a t i o n；t h e o p t i mi z a t i o n o f p roc e s s d o i：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 4 5 0 6 X 2 0 1 0 0 2 0 1 6 中国传统酱肉是我国具有地方特色的传统发酵 肉制品，因其独特的色香味深受人们的喜爱。但 目前 大多为手工作坊式加工，没有形成工业化生产，且是 自然发酵，没有商品化的专用发酵剂，因此该产品与 我国许多传统 肉制品一样，存在着许多问题，如生产 受季节区域限制，加工周期长，质量不稳定，安全性 得不到保障I I。相对于其它发酵 肉制品的国内外研 究12-9 ，目前关于中国传统酱肉的现代加工工艺、加工 过程中微生物的菌相变化规律及其发酵作用机理和 产品成熟机理的研究尚未见报道。李洪军I l 川 等从传 统自然发酵酱肉中分离得到了主要的微生物为乳酸 菌和酵母 菌。本研究以此为依据，从标准微生物发酵菌种中 优选出纯的优 良菌种用于传统酱肉的加工，对发酵 工艺参数进行优化，用科学的工艺参数对其加工过 程进行有效控制，为我国传统酱肉标准化生产提供 理论依据和技术参数。1 材 料与 方法 1 1 材料 与试 剂 1 1 1 实验原辅料 鲜猪肉、酱料、食盐、白糖、葡萄糖等购于重庆重 百北碚商场 中心店。1 1 2 实验菌种 标准乳酸菌(6 株)：短乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸 收稿 日期：2 0 1 0-0 3 1 5 基金项 目：国家 9 7 3 项 目(2 0 o 9 C B l 1 8 8 0 6)；“十一五”国家科技支撑计划项 目(2 o 0 7 B A D 5 l B 0 6)作者简介：邹忠义(1 9 8 2 一)，男，博士研究生，研究方向为现代食品加工理论与技术。通讯作者：李洪军(1 9 6 1 一)，男，教授，博 士，研究方 向为肉类科学与酶工程。第 4 6卷(遐第 1 5 6霸)邹忠义等：酱 肉发 酵菌种 的筛选及发酵工艺优化 链球菌，乳酸乳球菌，干酪乳杆菌，肠膜 明串珠菌。随 机编号分别为L l，L 2，L 3，I J 4，L 5，L 6。标准酵母 菌(6 株)：葡萄酒酵母，9 号葡萄酒酵母，啤酒酵母，鲁 氏酵 母，异常汉逊酵母变种，异常汉逊酵母。随机编号分 别为Y1，Y 2，Y 3，Y 4，Y 5，Y 6。标准菌种均购于中国科 学院菌种保藏中心。1 1 3 培养 基 牛肉膏蛋 白胨培养基、MR S 培养基、盂加拉红培 养基的制备参照G B 厂 r 4 7 8 9 2 8 2 0 0 3，豆芽汁培养基 参照文献】，药 品及试剂 由西南大学食品科学学院 食品微生物与发酵工程实验室提供，均为化学纯或 分析纯。1 2 主要 仪 器与设 备 J D 2 0 0 3 型 电子天平沈阳龙腾 电子称量仪器 有限公司；S WC J 一 1 F 型超净工作台 江苏苏净安泰空 气技术有限公司；7 2 2 s 分光光度计7 5 2 C 上海第三 分析仪器厂；2 1 C R 6电热恒温水浴锅广东省医疗 器械厂；S C 1 0 1 一 l鼓风 电热干燥箱上海高机实业 总公司；哈纳酸度离子计p H 2 1 1 北京哈纳科仪科技 有 限公 司；7 9 一 l 磁力加热搅拌器江苏省金坛市金 城 国胜实验仪器厂；箱式电阻炉上海跃进 医疗器 械 厂；D Z 6 0 0 2 S 真空包装机上海人 民包装 股份 有 限公 司。1 3 实验 方 法 1 3 1 菌种 的 活化 将保藏的乳酸菌分别接种于MR S 固体斜面试 管 中，置于3 7 培养箱中培养1 8-2 0 h，再转入MR S 液体 培养基中培养一代，置于冰箱4 贮存。将保藏的酵 母菌分别接种于豆芽汁固体斜面试管中，置于2 8 培养箱中培养4 8 h，再转入豆芽汁液体培养基中培养 一代，置于冰箱4 0(3 贮存【1 2】。1 3 2 乳酸菌的优选 1 3 2 1 乳酸菌生长曲线的测定 采用 比浊法测定乳酸菌生长 曲线【1 1。用无菌 吸 管 吸 取 3 mL待 测 菌 株 的 活 化 培 养 液 转 入 盛 有 1 0 0 mL MR S 的2 5 0 mL 无菌三角瓶中，混合均匀后分别 取5 mL 混合液放入有标记 的无菌试管中。将 已接种 的试管置摇床3 7 震荡培养2 4 h(振荡频率1 5 0 r mi n)，每隔3 h 将有相应标记 的试管取出，立即放人冰箱 中 4 贮存，最后用7 2 2 s 分光光度计在可见光6 0 0 n m波 段处，测定每个试管中培养液 的吸光度值，以0 h 的培 养液为空白对照。1 3 2 2 乳酸菌产酸性能测定 参照1 3 2 乳酸菌生长 曲线的测定方法接种和培 养乳酸菌，每隔3 h 用p H 计测定其液体培养基p H 值。1 3 2 3 乳酸菌高密度细胞培养 将活化好 的乳酸菌，接种于装有1 0 0 m L MR S 液 体培养基的2 5 0 m L 角瓶 中，3 7 培养1 8 h，作稀释平 板计数f 阍。1 3 3 酵母菌的优选 l-3 3 1 酵母菌生长曲线的测定 参照1 3 2 埒L 酸菌生长曲线 的测定方法接种和 培养酵母菌，培养基为豆芽汁液体培养基，2 8 培养 4 8 h，每隔6 h 将有相应标记的试管取 出，立即放人冰 箱中4 C 贮存，最后一同用分光光度计测定每个试管 中培养液的吸光度值，以0 h 的液体培养基为空白对 照。1 3 _ 3 2 酵母菌高密度细胞培养 参照1 3 2 3，将活化好 的酵母菌，接种于装 有 1 0 0 m L 豆芽汁液体培养基的2 5 0 mL=角瓶 中，2 8 培 养4 8 h，作稀释平板计数。1 3 3 3 酵母菌发酵香气评价 将活化好 的酵母 菌，接种于装有1 0 0 mL 豆芽汁 液体培养基的2 5 0 m L _角瓶 中，2 8 培养4 8 h，对发酵 液按照表1 进行发酵香气感官评分”6 1。表1 香气 评定标准 T a b 1 E v a l u a t io n s tan d a r d s o f a r o ma 1 _ 3 4 乳酸菌与酵母菌之间的拮抗实验 采用琼脂 移块 法 来进行菌种筛选，通过观察 有无抑菌圈来确定两菌种之间是否存在拮抗关系。1 3 5 发酵工艺条件的优化 1 3 5 1 川式酱肉的加工工艺流程 发酵剂 原料肉处理 腌制 发酵一烘制_ 冷却 包 装 一 成 品 1 3 5 2 发酵工艺优化试验 影响酱 肉发酵的主要因素有酵母菌与乳酸菌的 配比、接种量、葡萄糖添加量和发酵时间 9 1。故设计 了1 个4 因素、3 水平的正交试验，选用正交表I J 9(3 4)进 行4 因素3 水平的正交试验，对最佳发酵剂进行研究。试验因子和水平如表2 所示。1 3 5 3 酱肉的感官鉴评 食 品 与 发 酵,1 4-技 2 0 l 0 年第 2 期 表2正交试验 因子水平表 T a b 2 L e v e l o f f a c t o r s i n o r th o g o n a l e x p e r ime n t 将待检样品切成0 3 e m薄片，挑选7 名评定者在 饭后2 h 3 h 对不同试验组酱肉的色泽、风味和组织状 态进行感官评分，评定标准如表3 所示 1 6,1 9 1。最后根据 分数高低，以确定最佳工艺参数。表3 川 I 式酱肉感观评定标准 T a b 2 S e n s o r y e s t i ma t i o n s t a n d a r d o f S ic h u a n ty p e p o r k c u r e d wit hsoy s a u c e 分值、项目 色泽 风味 组织形态 皮呈灰色、肥膘 组织不柔软，软 呈白色、瘦肉呈 无明显酱香味，硬不适度，块形 03 0分 风味较差，肉质 不均匀，形态不 灰黄色，表面无 发硬 光泽 完整 皮呈淡黄色、肥 组织较柔软，软 膘 呈 白色 略透 酱香味偏淡，风 硬教适度，块形 3 06 0分 味一般，肉质偏 亮、瘦肉灰红色，硬 较均匀。形态教 表面略有光泽 完整 皮呈金黄色、肥 膘晶莹透亮、瘦 酱香浓郁，鲜美 组织柔软，软硬 6 0 1 0 0分 醇香，肥而不腻。适度，块形大致 肉呈玫瑰红，表 面有光泽 人E l 化渣 均匀，形态完整 单项总分 3 0分 4 0 分 3 O分 总分 1 0 0分 2 结果与分析 2 1 乳 酸菌 的优 选 2 1 1 乳酸菌的生长曲线 1 0 o o O 0 O h 3 h 6h 9h 1 2 h 1 5h 1 8 h 21 h 2 4h 时间 图1 六株乳酸菌的生长 曲线 F _叼 1 Gr o w t h c u r v e o f s ix L a c t o b a c il lu s +L 1 +L 2 +L 3 *L 4 一L5 +L 6 由图l 可以看出，将六株乳酸菌接种于MR S 液体 培养基，在3 7 条件下振荡培养2 4 h 的过程中，大多 数在大约3 h 后进入对数生长期，1 2 h 后进入稳定生长 期，大约1 8 h 后进入稳定生长期。2 1 2 乳酸菌的产酸性能 趔 工 Q L1 L 2 L 3 t L 4 一L 5 r L 6 Oh 3n 6 h 9h 1 2 h 1 bh 1 8 n 21 h 2 4h 时间 图2 六株乳酸菌2 4 h 内的产酸变化 F ig 2 Ch a n g e s o f a c id p r o d u c e d b y s ix L a c to b a c i llu sin 2 4 h 从图2 可以看 出，将六种乳酸菌接种于MR S 液体 培养基，在3 7 条件下振荡培养2 4 h 的过程中，六株 乳酸菌培养液的p H值呈明显下降趋势。大约在1 8 h 后，大部分乳酸菌的培养液p H值保持稳定。在整个 培养过程过程 中，L 3 培养液的p H值降低速度最快，且一直保持为最低值。在1 8 h 时，L 3 的培养液p H 值最 低为5 0 7，其余五种乳酸菌的培养基p H 值为L l：5 4 5，12：5 4 1，L 4：5 3 4，L 5：5 3 9，L 6：5 5 6。说 明L 3 的产酸能 力最强。故本实验选择乳酸菌L 3 作为发酵剂主要产 酸菌，使p H值迅速降低，抑制了其他杂菌的生长，保 证发酵过程的顺利进行。2 1-3 乳酸菌高密度细胞培养活菌数 3 8 量 己5 4 ；3 L 1 L2 L 3 L 4 L 5 L 6 菌种 图3 六株乳酸菌在对数期时达到的活菌数 F i g 3 C o u n t o f l iv e b a ct e r ia o f s ix L a c t o b a d l u s a t a nt h m e p h a s e 从图3 可以看出，将六种乳酸菌接种于MR S 液体 培养基 中，在3 7 c I=条件下振荡培养至2 4 h，各乳酸菌 培养液中的活菌数分别为：L I(9 0 5 x 1 0 C F U m L)，1 2 (1 6 0 x 1 0 0 C F U mL)，1 3(1 9 0 x l 0 C F U mL)，L 4(1 3 4 l 0 8 C F U mL)，L 5(1 8 O x l 0 C F U m L)，L 6(4 5 0 x 1 0 F U mL)。其 中L 3 培养液中的活菌数最少，L 6 培养液中的 活菌数最多。这是因为L 3 的产酸能力最强，在培养过 程 中，其迅速地产生大量的乳 酸，使其培养 液的p H 值降为最低，从而抑制了本身的生长。2 2 酵母 茵的优 选 2 2 1 酵母菌的生长 曲线 由图4 可以看出，将六株酵母菌接种于豆芽汁液 体培养基，在2 8 条件下振荡培养4 8 h 的过程 中，大 弗 4 6卷(鼍第 1 5 6期)邹忠义等：酱肉发酵菌种的筛选及发酵工艺优化 6 7 2 0 6 O+Y1 十Y2 4 1-Y3 一 Y4 一Y5 -Y6 O h 3h 6h 9h 1 2h 1 5h 1 8 h 21 h 2 4h 时间 圈4六株 酵母菌的生长曲线 F i g 4 Gr o w t h c u r v e o f s ix y e a s t s 多数在大约2 4 h 结束对数生长期，进入稳定生长期。其 中Y 4 和Y 6 进入稳定生长期的速度 较慢，分别在 3 0 h 和3 6 h 后才进入稳定生长期。Y 5 在2 4 h 后，其培 养液菌体密度一直保持最高。2 2 2 酵母菌高密度细胞培养 己 I I -I I Y1 Y2 Y3 Y 4 Y5 Y6 菌种 圈5 六株酵母菌在对数期时达到的活菌数 F i O 5 C o u n t o f liv e y e a s t o f s ix y e a s t s a t lo g a ri t h mic p h a s e 从 图5 可以看出，将六种酵母菌接种于豆芽汁液 体培养基 中，在2 8 条件下振荡培养 至3 6 h，各酵母 菌培养液中的活菌数分别为：Yl(1 1 O x l O S C F U m L)，Y 2(9 3 0 x l O C F U mL)，Y 3(6 5 0 x l O C F U m L)，Y 4(1 6 0 x I O S C F U m L)，Y 5(2 0 3 x 1 0 S C F U mL)，Y 6(6 4 5 x l O C F U m E)。其 中Y 5 培养液中的活菌数最大。说明其生长繁 殖力 最强。2 2-3 酵母菌发酵香气评价 5 4 3 李 2 晦-0 f。I Y1 Y2 Y3 Y 4 Y 5 Y6 菌种 圈6 六株 酵母 菌发 酵所产 生香气评分 F Ig 6 E v a l u a t io n o f a r o m a p r o d u c e d b y s ix y e a s t s 由图6 可以看出，将六种酵母菌接种 于豆芽汁液 体培养基，在2 8 条件 下振荡培养4 8 h，然后对其 发 酵液根据表l 进行香气评分，六种酵母菌发酵所产生 的香气评分高低顺序为Y 5 Y 2 Y 6 Y 3 Y1 Y 4，酵 母菌Y 5 发酵所产生的醇香味和酯香味最为浓烈，可 接受性最好。通过 以上两个试验，考虑将酵母菌Y 5 作为酵母 菌发酵菌种。2 3 乳 酸 菌与酵母 茵之 间的拮 抗 实验 图7 L 3 对Y 5 的拮抗实验图片 F _g _7 P h o t o o f a n t a g o n i s t e x p e r im e n t o f L 3 t o Y 5 圈8 Y5 对 L 3 的 拮 抗 实 验 图 片 F ig 8 P h o t o o f a n t a g o n is t e x p e r ime n t o f Y5 t o L 3 由图7 与图8 可 以看出，乳酸菌L 3 与酵母菌Y 5 之 间无拮抗作用。所以可将乳酸菌L 3 与酵母菌Y 5 搭配 使用，作为混和发酵菌种。2 4 正 交试 验优 化发 酵 工 艺结果 由表4 正交试验结果表明，在酱 肉发酵过程中，四个因子对结果影响由大到小为酵母菌与乳酸菌的 比例 接种量 发酵时间 葡萄糖添加量。最优组合 为A 3 B 2 D 3 C。，即当酵母菌Y 5 与乳酸菌L 3 比例为1：4，接 种量为2，发酵时间为4 8 h，葡萄糖添加量为0 2 时，发酵所得酱肉的感观评分最高。3结论 通过产 酸性 能测定得 出六 种标准乳 酸菌菌种 中，L 3 产酸能力最强，将L 3 作为发酵剂中的产酸菌。通过发酵试验得出五种标准酵母菌菌种中，酵母菌 食 品 与 友 醇 科 技 2 0 l O 年第2 期 表4 正交试验结果表 T a b 4 R e s u lt s o f o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t Y 5 发酵所产生的醇香味和酯香味最浓，且在高密度 细胞培养时活菌数比较大，故将 酵母菌Y 5 作为酵母 菌发酵菌种。通过乳酸菌与酵母菌之间的拮抗试验 得知，乳酸菌L 3 与酵母菌Y 5 之 间无拮抗作用，可作 为混和发酵菌种。正交试验结果表明，最佳发酵工艺 参数为：酵母菌Y 5 与乳酸菌L 3 比例为l：4，接种量为 2，3 0 发酵时间为4 8 h，葡萄糖添加量为0 2。本文对我 国传统酱肉的现代加工工艺做了初步 的探讨，对其 自然发酵工艺进行了改进，通过人工接 种筛选的标准菌种，对其加工过程进行控制，可为我 国传统酱肉的标准化生产提供参考依据。关于我国 传统酱 肉加工过程中微生物的菌相变化规律及其发 酵作用和产品成熟机理，还有待深入研究。后续研究中可从 自然发酵酱肉中分离筛选发酵 菌株，运用生物技术，构建基因工程菌，提高其生产 力和安全性【彻，开发商品化 的酱 肉专用发酵剂，运用 于酱 肉的工业化生产。参考文献：【1】励建荣 中国传统肉制品的现代化 J 食品科学，2 0 0 5，2 6(7)：2 4 7-2 5 1 【2】HU G A S M，MO N F O R T J M B a c t e r i a l s t a r t e r c u l t u r e s f o r m e a t f e r m e n 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l a c t i c a c i d b a c t e ri a a n d s t a p h y l o c o c c i i s o l a t e d f r o m t r a d i t i o n a l l y f e r me n t e d s a u s a g e s i n s o u t h e r n G r e e c e,F o o d Mi c r o b i o l o gy，2 0 0 6，2 4：1-1 1 【8】J O O Y L C H E O N J K a n d B E N N O K I d e n t i f i c a t i o n o f l a c t i c a c i d b a c t e ria i s o l a t e d f r o m k i mc h i a n d s t u d i e s o n t h e i r s u i t a b i l i t y f o r a p p l i c a t i o n a s s t a rt e r c u l t u r e i n t h e p r o d u c t i o n o f f e r m e n t e d s a u s a g e s【J】M e a t S c i e n c e，2 0 0 6，3：4 3 7 4 4 5 【9】周传云，聂明，万佳蓉 发酵肉制品的研究进展 J 食品 与机械，2 0 0 4，2 0(2)：2 7-3 0 【1 0 李洪军，邹忠义，贺稚非等 传统酱 肉中优势微生物的 分离与鉴定【J】食 品科学，2 0 0 8，2 9(9)：4 1 3-4 1 9 1 1 陈天寿 微生物培养基的制造与应用【M】北京：中国农 业出版社，1 9 9 5 【l 2】周德 庆 微生物学实验 手册f M】上海：上海科学技术出 版社，1 9 8 6 【l 3】王永霞，牛天贵 肉品混合发酵剂的筛选及应用研究【J】食品科技，2 O o 4，8：3 4 3 8 【1 4 张红诚，闵连杰，倪晨 发酵肠生产中乳酸菌的选择【J 食品科学，1 9 9 6，1 7(8)：2 5 2 9 1 5】吴丽红 J I I 味香肠发酵过程中微生物 区系及发酵剂的 研究【D】重庆：西南大学，2 0 0 6 【1 6 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