CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.doc

CＣＫ8检测细胞增殖/毒性得原理、方法及注意事项
 一、ＣＣK８检测细胞增殖/毒性得原理

Cell Countｉｎg Kit—8(简称CCK—8)试剂可用于简便而准确得细胞增殖与毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WＳＴ—8【化学名:2-(2-甲氧基－4-硝基苯基)—3-(４-硝基苯基)—5－(2,4-二磺酸苯)－2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基－5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Meｔhoxy　PMS)得作用下被细胞中得脱氢酶还原为具有高度水溶性得黄色甲瓒产物(Fｏrｍａzaｎ dye)。生成得甲瓒物得数量与活细胞得数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析。

用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CＣＫ8得优点:
· 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂;
· CCK－8法能快速检测;
· CＣK—8法得检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;
· ＣＣK-８法得重复性优于MTT 法;
· CCK-８法对细胞毒性小;
· CCK－8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。
ﻫCCK８得缺点:
· 与MTT法相 比,CCK8与XＴT得价格比较贵、
· CCＫ8试剂得颜色为淡红色,与含酚红得培养基颜色接近,不注意得话容易产生漏加或多加。

与以往得增殖／毒性测定试剂相比较:ﻫ
检测方法
ＭTT法
XTＴ法
ＷST－1法
CＣK8法
甲臢产物得水溶性
差(需加有机溶剂溶解)
好
好
好
产品性状
粉末
2瓶溶液
溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
现配现用
即开即用
即开即用
检测灵敏度
高
很高
很高
高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长
５60—600nm
42０-４8０nm
４20－480nｍ
４３０－49０nm
细胞毒性
高,细胞形态完全消失
很低,细胞形态不变
很低,细胞形态不变
很低,细胞形态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般
很好
批量样品检测
可以
非常适合
非常适合
非常适合
便捷程度
一般
便捷
便捷
非常便捷

二、ＣCＫ8检测细胞增殖／毒性得方法
实验一:细胞增殖分析
1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到９６孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样得样本可做3个重复。
３、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养２-４小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入1０ul　CＣK8:由于每孔加入CＣK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀、或者直接配置含１0％ＣＣK8得培养基,以换液得形式加入。ﻫ5、培养1－４小时:细胞种类不同,形成得Ｆoｒmazan得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成得Ｆoｒmazaｎ很少,需要较长得显色时间(5—6小时)。
6、测定４50nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长45０-4９0nm,参比波长６00－６５0nm。

实验二:细胞毒性分析
1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约1０0ｕｌ细胞悬液,同样得样本可做３个重复。
3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入不同浓度得毒性物质
5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质得培养时间,要瞧毒性物质得性质与细胞得敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上得时间、
6、加入1０uｌ CCＫ8:由于每孔加入CCＫ８量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀、
７、培养１—4小时:细胞种类不同,形成得Ｆorｍazaｎ得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成得Foｒｍaｚaｎ很少,需要较长得显色时间(5—6小时)。
8、测定45０nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长４50—490ｎm,参比波长60０－650nm。

注:
· 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0、１M得HCＬ溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
· 如果待测物质有氧化性或还原性得话,可在加CＣK８之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新得培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小得情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后得空白吸收即可。
三、CCK8检测细胞增殖/毒性得注意事项
· 当使用标准96孔板时,贴壁细胞得最小接种量至少为1,00０ 个/孔 (１00 μl 培养基)。检测白细胞时得灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,5０0 个/孔 (100 μl 培养基)、
· 酚红与血清对CＣK8法得检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底得吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定得过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。
· CCＫ—8在0－5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存１年。
· 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈得孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差、一般情况下,最外一圈得孔只加培养基,不作为测定孔用。
· 在培养基中加入CCK8,培养一定得时间,测定450　nm得吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物得吸收,可在加入药物得培养基中加入CCK8,培养一定得时间,测定450 ｎm得吸光度作为空白对照、
· 金属对CCK—8显色有影响:当终浓度为１ mM得氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5％、15％、9０％得显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度就是１0 mM得话,将会100％抑制。
· 悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量与延长培养时间。