九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术-效果比较及评价.pdf
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1、中国生物工程杂志China Biotechnology,2012,32(6):84-92九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价刘雅莉1,2刘芳3韩舜愈1刘箐2*孙志博4夏俊芳1朱小清5(1 甘肃农业大学食品科学与工程学院兰州7300702 上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093)(3 甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心兰州7300204 兰州大学基础医学院兰州730000)(5 甘肃出入境检验检疫局兰州730020)摘要采用传统生物学方法、显色培养基方法、自制三抗体夹心 ELISA 试剂盒(TAS-ELISA)、基因组直接 PCR(DNA Direct-PCR)、菌裂解
2、直接 PCR(Bacterium Direct-PCR)、免疫捕捉 PCR(IC-PCR)、生物 PCR(Bio-PCR)、SYBR Green 染料实时荧光 PCR(SYBR Green Real time-PCR)、探针实时荧光 PCR(TaqMan Real time-PCR)检测纯菌液及模拟带菌食品中的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)。结果表明:传统生物学培养方法出现假阳性;TAS-ELISA、DNADirect-PCR、Bacterium Direct-PCR、IC-PCR 最低检测限分别为 106、102、105、104CFU/ml;显色
3、培养基、SYBR Green Real time-PCR 灵敏度达 102CFU/ml;Bio-PCR、TaqMan Real time-PCR 检测灵敏度最高,均为 101CFU/ml。显色培养基、TAS-ELISA 操作简单,适合大量样品的初检;IC-PCR 具有灵敏、特异、快速、经济的优点,特别适合大体积样品中微量病原的检测;Bio-PCR、TaqMan Real time-PCR 灵敏度高、特异性好,适合阳性样品的复检以及科研使用。关键词单核细胞增生性李斯特菌三抗体夹心 ELISA免疫捕捉 PCR生物 PCR实时荧光定量 PCR中图分类号Q819收稿日期:2012-02-13修回日期:
4、2012-03-22*通讯作者,电子信箱:ciqql sohu com单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌,是李斯特菌属中致病力最强的细菌,也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌,可以导致严重的人畜共患传染病,如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988 年,世 界 卫 生 组 织(World Health Organization,WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”,指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒;自此,LM 成为新的重要的食源性疾病病原菌,WHO 将其与大肠杆菌O157 H157、沙门氏菌以及
5、金黄色葡萄球菌并列为 20世纪 90 年代四大食源性致病菌。目前,针对 LM 的检测技术主要有:显色培养基1、酶联免疫2、胶体金试纸条、Direct-PCR、免疫捕捉 PCR3、多重 PCR4-5、免疫磁珠 PCR6、生物 PCR7、实时荧光定量 PCR8-9、基因芯片10-11、变性高效液相色谱12、色谱-质谱分析13 等。但这些检测技术有些未列入检测标准,有些技术本身存在缺陷,有些适用范围有限,为了进一步明确这些方法的优劣,指导技术人员进行检测方法的选择,从而提高检出率、增加检测的敏感性和特异性、缩短检测周期、减少检测成本,研究结合本实验室近年的研究成果,用九种方法检测纯菌液及牛奶、果汁、
6、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉六种模拟带菌食品中的 LM,比较并评价了各技术的优缺点,明确了不同技术的适用范围。1材料与方法11材料与试剂脑心浸液肉汤购于 OXOID 公司;李斯特显色培养基购于博赛生物;LM 单克隆抗体(ab11439)、多克隆抗体(ab20506)购自 Abcam 公司;辣根过氧化物酶购于兰州鹏程生物公司;过碘酸钠购于 Sigma 公司;山羊抗兔2012,32(6)刘雅莉 等:九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价IgG 购于 Solarbio 公司;DNA 提取试剂盒、PCR 引物、探针及体系购于宝生物工程(大连)有限公司;SYBRGreen Realtime PCR
7、 Master Mix 购于 TOYOBO 公司;hly基因(234bp)针对的引物、探针14 序列如下:上游 5-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3、下游 5-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3、探针 5-(FAM)-AAATCATCGACGGCAACCTC-(TAMRA)-3。12方法121梯度菌液、模拟带菌菌液的制备、细菌组总DNA 的提取LM 标准菌株用脑心浸液肉汤培养后稀释 101108倍,并进行平板计数(各梯度纯菌悬液分别设 3 个重复),梯度菌液计数结果为 1 37 109 1 37101CFU/ml。取无 LM 感染的牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉 2
8、5g 或 25ml(固体样品充分碾碎后混匀)与 250ml 无菌磷酸盐缓冲液混合,以此为稀释液梯度稀释 LM 纯菌液,制备梯度模拟菌液。参照试剂盒说明书提取 LM 纯菌液及6 种食品模拟菌液的 DNA,并用无菌水梯度稀释该 DNA 制备梯度 DNA 模板。122脑心浸液培养基培养(BHA 平板培养)为提高实验的准确性,必须保证每个培养皿中含有等量的培养基,本实验为 15ml 培养基/培养皿。用无菌接种环蘸取 109 101CFU/ml 梯度菌液进行平板划线 37培养 24h,LM 在 BHA 培养基上呈乳白色单菌落。123显色培养基培养梯度菌液平板划线 37 培养 24h(15ml 培养基/培
9、养皿),在显色培养基上 LM 呈规则蓝色菌落(带有白色晕环、直径小于 3mm),而其他微生物菌落呈蓝色、无色、其他颜色或被抑制。124自制三抗体夹心 ELISA 试剂盒(TAS-ELISA)采用改良过碘酸钠法制备酶标抗体15。TAS-ELISA检测如下,LM 单克隆抗体包被酶联板 4 过夜;PBST洗涤后加入样品,372h;PBST 洗涤,封闭液 371h;洗涤后加入 LM 多克隆抗体 371 5h;洗涤并加入自制酶标抗体,37 1 5h;PBST 洗涤,TMB 显色 5 10min,浓硫酸终止反应,测 OD450,判断原则:样品 OD/阴性 OD 2 0 为阳性、样品 OD/阴性 OD 2
10、0 为阴性。125基因组直接 PCR(DNA Direct-PCR)以梯度DNA 为模板进行 Direct-PCR 扩增。扩增体系为含Mg2+的 Buffer(10 )5l,dNTP(各 2 5mmol/L)2l,Taq DNA Polymerase(5U/l)0 5l,引物(10pmol/l)各 3l,DNA 模板 2l,用去离子水补充至 50l;扩增条件为 95 2min,95 30s,55 45s,72 45s,725min,35 个循环,4保存;扩增产物用 1 5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像分析。1 2 6菌裂解直接 PCR(Bacterium Direct-PCR)以不同浓度菌液5l
11、为模板进行 Direct-PCR 扩增,其余成分同 DNA Direct-PCR;扩增条件为 95 20min,9530s,55 45s,72 45s,72 5min,35 个循环,4 保存;产物分析同 125 节。127自制免疫捕捉 PCR 试剂盒(IC-PCR)LM 单克隆抗体包被 PCR 管 4过夜,PBST 洗涤后每管加入5l 梯度菌液和 45l 灭菌水在 37温箱孵育 4h,再次洗涤后加入 PCR 母液体系进行 PCR 扩增(扩增体系、条件、产物分析同 Bacterium Direct-PCR)。128生物 PCR(Bio-PCR)取梯度菌液 1ml 用三角棒涂布于李斯特显色培养基上
12、,37 培养 24h 后用无菌接种针挑取 LM 单个菌落加入装有 PCR 母液体系的PCR 管中进行 PCR 扩增(扩增体系、条件、产物分析同Bacterium Direct-PCR)。12 9SYBR Green 实时荧光定量 PCR(SYBR GreenReal time-PCR)由于该法极易导致引物二聚体产生,分别加入 08、06、04、02l 引物(10pmol/l)、SYBRGreen Mix 10l、模板(103、105、107CFU/ml 菌液)2l,灭菌水补至 20l 进行优化实验;扩增条件为 95裂解5min,1cycle;95 30s、59 1min、72 30s,40cy
13、cle;融解曲线 95 0s、65 15s、95 0s、40 0s。1210探针法实时荧光定量 PCR(TaqMan Real time-PCR)将引物、探针进行不同比例组合以选择最优反应体系;利用优化的体系检测 LM 纯菌液及 6 种模拟菌液,扩增条件为 95 5min,95 15s,60 1min,40 个循环。2结果分析21传统生物学方法检测结果纯菌液及 6 种食品的梯度菌液于 BHA 平板 37培养 24h,从图 1 可以看出该方法在纯菌液、牛奶、果汁中的检测灵敏度分别为 102、103、104CFU/ml,而在酸奶、雪糕、香肠、生猪肉中都出现假阳性(图 1 中的阴性对照 D10、E1
14、0、F 10、G10 有杂菌生长,肉眼不能判断、只能通过 PCR 验证),说明该方法特异性不好,通常还需进行分子生物学鉴定。22显色培养基方法检测结果图 2 显示,纯菌液、牛奶、果汁、香肠的检测灵敏度可达到102CFU/ml,酸奶、雪糕、生猪肉的检测灵敏度分58中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 32 No 6 2012图 1传统生物学方法(BHA 平板培养)检测结果Fig 1The result of traditionalbiological methods(BHA)A G:bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,po
15、psicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium fluid(109 101CFU/ml);10:Negative control别为 104、103、105CFU/ml;生 猪 肉 的 阴 性 对 照(图2G10)有淡黄色非目标菌落生长,说明在该生猪肉样品中有大量其他杂菌,而该方法可以肉眼判读,特异性好、简便易操作。23自制 TAS-ELISA 试剂盒检测结果自制 TAS-ELISA 试剂盒纯菌液及牛奶、果汁、酸图 2李斯特显色培养基检测结果Fig 2The result of chromogenic medium methodA G:Bacterial
16、suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium fluid(109 101CFU/ml);10:Negative control奶、雪糕、香肠、生猪肉的检测灵敏度分别为:106、107、107、107、106、108、109CFU/ml。2 4DNA Direct-PCR、Bacteria Direct-PCR、IC-PCR、Bio-PCR 检测结果提取 LM 纯菌液及牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉 6 种模拟带菌食品的 DNA 后进行 DNA Direct-PCR 扩增,其检测灵敏
17、度差异较大(图 3),分别为 102、682012,32(6)刘雅莉 等:九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价图 3DNA Direct-PCR 检测结果Fig 3The result of DNA Direct-PCRM:Marker;A G:Bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium(109 101CFU/ml);H2O:Negative control105、104、104、104、104、109CFU/ml。而 Bacteria Direct-P
18、CR 的检测灵敏度分别为 105、106、106、106、105、106、109CFU/ml(图 4)。IC-PCR 的检测灵敏度分别为 104、105、105、104、104、105、108CFU/ml(图 5)。采用 Bio-PCR 检测纯菌液及 6 种食品中的 LM,检测灵敏度较高,均可达到 101CFU/ml(图 6)。25SYBR Green Real time-PCR 检测结果优化实验结果表明:引物量为 0 2l 时(图 7D)扩增曲线 CT 值与模板浓度呈现良好的线性关系,融解曲线只出现扩增产物的特异峰,没有引物二聚体或非特异性扩增产物出现。如图 8 所示:该方法在纯菌液、牛奶、
19、果汁、雪糕109102CFU/ml 中呈现出良好的 S 型扩增曲线,灵敏度为 102CFU/ml;在酸奶、香肠、生猪肉中检测限为103CFU/ml。26TaqMan Real time-PCR 检测结果该方法确定的最优扩增体系为:Permix Ex Taq图 4Bacteria Direct-PCR 检测结果Fig 4The result of Bacteria Direct-PCRM:Marker;A G:Bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 8:Gradient bacterium(109 102
20、CFU/ml);H2O:Negative control图 5IC-PCR 检测结果Fig 5The result of Bacteria IC-PCRM:Marker;A G:Bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 8:Gradient bacterium(109 102CFU/ml);H2O:Negative control78中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 32 No 6 2012图 6Bio-PCR 检测结果Fig 6The result of Bacteria
21、Bio-PCRM:Marker;A G:Bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium(109 101CFU/ml);H2O:Negative control图 7SYBR Green Real time-PCR 优化结果Fig 7The optimization result of SYBRGreen Real time-PCRA D:Primer was 0 8,06,04,0 2l;1 3:Gradientbacterium(103,105,107CFU/ml)图
22、 8SYBR Green Real time-PCR 检测结果Fig 8The result of SYBR Green Real time-PCRA G:Bacterial suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium(109 101CFU/ml);10:Negative control(H2O)10l、正负引物(10pmol/l)0 5l、探针(10pmol/l)1l、DNA 模板2l(图9)。采用该法检测LM 纯菌液及6种模拟带菌食品的灵敏度均为101CFU/ml(图10)。图 9
23、TaqMan Real time-PCR 体系优化结果Fig 9The optimization result of TaqManReal time-PCR1 9:Primer was 0 5,0 5,0 5,0 4,0 4,0 4,0,0 3,03l;1 9:Probe was 1 0,0 5,0 25,0 8,0 4,0 2,0 6,03,015l882012,32(6)刘雅莉 等:九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价图 10TaqMan Real time-PCR 检测结果Fig 10The result of TaqMan Real time-PCRA G:Bacteria
24、l suspensions,milk,juice,yoghourt,popsicle,sausage,pork;1 9:Gradient bacterium(109 101CFU/ml);10:Negative control(H2O)3讨论将以上 9 种检测技术从检测灵敏度、特异性、检测周期、成本等方面进行比较(表 1、表 2)。31BHA 培养常规划线培养 24h,操作简单,成本低(1 5 元/培养皿),但经常会出现假阳性、检测特异性不强,通常需与其他方法同时检测才能得到可靠的实验结果。32李斯特显色培养基操作简单、灵敏度高、特异性好,结果肉眼可判读,但成本较高(20 元/培养皿),适合有
25、条件的实验室对大量样品的初检。王海艳等16 的实验证明:LM 在显色培养基上具有特征性菌落形态易与其他李斯特菌相区别,且 PR 值很高,从菌落形态、产率和选择性等几方面综合考虑,作者推荐使用该显色培养基。33自制 TAS-ELISA 试剂盒从缓冲液的配制到酶标抗体的制备都是本实验室独立完成,与商业化 ELISA 试剂盒相比具有同样的检测限,但是检测成本大大降低(3 5 元/孔),检测时间6h,特异性实验、干扰实验、稳定性实验、质量控制实验显示该试剂盒特异性强、可重复性好、4 保存 3 个月仍有较好的检测效果15,该自制酶标抗体的检测效果可以达到甚至超过商业化酶标抗体15。适合大量样品的初筛。3
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