CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.pdf

CCK8CCK8 检测细胞增殖检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项毒性的原理、方法及注意事项一一、CCK8CCK8 检检测测细细胞胞增增殖殖/毒毒性性的的原原理理Cell Counting Kit-8（简 称 CCK-8）试 剂可 用于 简便 而准 确的细 胞增 殖和毒 性分 析。其基基本本原理原理 为：该试 剂中 含有 WST-8【化 学名：2-(2-甲氧基-4-硝基 苯基)-3-(4-硝基苯 基)-5-(2,4-二磺酸 苯)-2H-四唑单钠 盐】，它在 电子 载体 1-甲氧基-5-甲基 吩嗪 鎓硫酸 二甲 酯（1-Methoxy PMS）的作用 下被 细胞 中的 脱氢酶 还原 为具 有高 度水溶 性的 黄色 甲瓒 产物（Formazan dye）。生成 的甲 瓒物 的数 量与活 细胞 的数 量成 正比。因此可利 用这 一特 性直 接进行 细胞 增殖 和毒 性分析。用用途途：药物 筛选、细 胞增 殖测 定、细胞 毒性测 定、肿瘤 药敏 试验CCK8CCK8 的的优优点点：使用 方便，省 去了 洗涤细 胞，不需 要放 射性同 位素 和有 机溶 剂；CCK-8 法能 快速 检测；CCK-8 法的 检测 灵敏 度很 高，甚至 可以 测定较 低细 胞密 度；CCK-8 法的 重复 性优 于 MTT法；CCK-8 法对 细胞 毒性 小；CCK-8 细胞 活性 检测 试剂 中为 1 瓶溶 液，毋需 预制，即 开即 用。CCK8CCK8 的的缺缺点点：与 MTT 法相比，CCK8 和 XTT 的价格 比较 贵。CCK8 试剂的 颜色 为淡红 色，与含酚 红的 培养 基颜 色接 近，不注意的话 容易 产生 漏加 或多加。与与以以往往的的增增殖殖/毒毒性测性测 定定试试剂剂相相比比较较：检测方法检测方法MTTMTT 法法XTTXTT 法法好WST-1WST-1 法法好CCK8CCK8 法法好甲臢产物的水甲臢产物的水差（需加有机溶性溶性产品性状产品性状使用方法使用方法检测灵敏度检测灵敏度检测时间检测时间检测波长检测波长细胞毒性细胞毒性试剂稳定性试剂稳定性批量样品检测批量样品检测便捷程度便捷程度溶剂溶解）粉末配成溶液后使用高较长2 瓶溶液现配现用很高较短溶液即开即用很高较短1 瓶溶液即开即用高最短560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm高，细胞形态 很低，细胞形 很低，细胞形 很低，细胞形完全消失态不变态不变态不变一般可以一般较差非常适合便捷一般非常适合便捷很好非常适合非常便捷二二、CCK8CCK8 检检测测细细胞增胞增 殖殖/毒毒性性的的方方法法实实验验一一：细细胞胞增增殖殖分分析析1、制备 细胞 悬液：细胞 计数2、接种 到 96 孔板 中：根据 合适 的铺 板细 胞数，每孔 约 100ul 细胞 悬液，同样 的样 本可 做 3 个重复。3、37培养箱 中培 养：细胞 接种 后贴 壁大约 需要 培养 2-4 小时，如果不需 要贴 壁，这步 可以省 去。4、加入 10ul CCK8：由于 每孔 加入 CCK8 量比 较少，有可能 因试剂 沾在孔壁 上而 带来 误差，建议 在加 完试 剂后 轻轻敲 击培 养板 以帮 助混匀。或者直 接配 置含 10%CCK8 的培 养基，以 换液的 形式 加入。5、培养 1-4 小时:细胞种 类不 同，形成 的 Formazan 的量 也不一 样。如果显 色不 够的 话，可 以继 续培 养，以确 认最佳 条件。特别是 血液细 胞形成的 Formazan 很少，需 要较 长的 显色 时间（5-6 小时）。6、测定 450nm 吸光度：建议采 用双 波长 进行 测定，检测 波长 450-490nm，参比 波长 600-650nm。实实验验二二：细细胞胞毒毒性性分分析析1、制备 细胞 悬液：细胞 计数2、接种 到 96 孔板 中：根据 合适 的铺 板细 胞数，每孔 约 100ul 细胞 悬液，同样 的样 本可 做 3 个重复。3、37培养箱 中培 养：细胞 接种 后贴 壁大约 需要 培养 2-4 小时，如果不需 要贴 壁，这步 可以省 去。4、加入 不同 浓度 的毒性 物质5、37培养箱 中培 养：加入 毒性 物质 的培养 时间，要 看毒 性物质 的性质和 细胞 的敏 感性，一般 要根 据细 胞周 期来决 定，起 码要 一代 以上 的时间。6、加入 10ul CCK8：由于 每孔 加入 CCK8 量比 较少，有可能 因试剂 沾在孔壁 上而 带来 误差，建议 在加 完试 剂后 轻轻敲 击培 养板 以帮 助混匀。7、培养 1-4 小时:细胞种 类不 同，形成 的 Formazan 的量 也不一 样。如果显 色不 够的 话，可 以继 续培 养，以确 认最佳 条件。特别是 血液细 胞形成的 Formazan 很少，需 要较 长的 显色 时间（5-6 小时）。8、测定 450nm 吸光度：建议采 用双 波长 进行 测定，检测 波长 450-490nm，参比 波长 600-650nm。注注：若暂 时不 测定 OD 值，可以向 每孔 中加入 10 L 0.1M 的 HCL 溶液或者 1%w/v SDS溶液，并遮 盖培 养板 避光保 存在 室温 条件 下。24 小时内 测定，吸 光度 不会 发生 变化。如果 待测 物质 有氧 化性或 还原 性的 话，可在加 CCK8 之前更 换新鲜培 养基（除 去培 养基，并用 培养 基洗 涤细胞 两次，然 后加 入新的培 养基），去掉 药物影 响。当然 药物 影响比 较小 的情 况下，可以不 更换 培养 基，直接扣 除培 养基 中加 入药物 后的 空白 吸收 即可。三、三、CCK8CCK8 检检测细测细 胞胞增殖增殖/毒毒性性的注的注 意事意事 项项当使 用标 准 96 孔板时，贴 壁细 胞的 最小 接种 量至 少为 1,000个/孔(100 l培养基)。检测白 细胞 时的 灵敏度 相对 较低，因此推荐接种 量不 低于 2,500个/孔(100 l培养基)。酚红 和血 清对 CCK8 法的 检测 不会 造成 干扰，可以 通过 扣除 空白孔中 本底 的吸 光度 而消去。CCK8 可以检 测大 肠杆菌，但不 能检 测酵 母细 胞。在细胞 增殖 实验每次 测定 的过 程中 需要避 免细 菌污 染，以免影 响结 果。CCK-8 在 0-5下能够保 存至 少 6 个月，在-20下避 光可 以保存1 年。当在 培养 箱内 培养 时，培 养板 最外 一圈 的孔最 容易 干燥 挥发，由于体 积不 准确 而增 加误差。一般情 况下，最外 一圈 的孔 只加 培养基，不作 为测 定孔 用。在培 养基 中加 入 CCK8，培 养一 定的 时间，测 定 450 nm 的吸光度即为 空白 对照。在 做加药 实验 时，还应 考虑药 物的 吸收，可 在加入药 物的 培养 基中 加入 CCK8，培 养一 定的时 间，测定 450 nm 的吸光 度作 为空 白对 照。金属 对 CCK-8 显色有影 响：当终 浓度 为 1 mM 的氯化 亚铅、氯 化铁、硫酸 铜会 抑制 5%、15%、90%的显 色反 应，使 灵敏 度降 级。如果 终浓 度是 10 mM 的话，将 会 100%抑制。悬浮 细胞 由于 染色 比较困 难，一般 需要 增加细 胞数 量和 延长 培养时间。