单核细胞增生李斯特菌复合抑菌剂的研究.pdf

344潘利华，刘竹青，于荟，陈有亮*(浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058)摘要:单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)在 04也能生长，为确保冷却肉卫生安全，必须阻止肉中污染的 LM 的生长繁殖。本实验通过研究不同抑菌剂对 3 株 LM 的最小抑菌浓度(MIC)，选取了 聚赖氨酸、Nisin、曲酸三种抑菌剂，利用响应面法找出最佳组合。结果表明:聚赖氨酸、Nisin、曲酸对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为 50g/mL、200g/mL、6.4mg/mL。当 聚赖氨酸、Nisin、曲酸的浓度分别为 20.5g/mL、184.6g/mL、4.37mg/mL 时对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用最佳。关键词:聚赖氨酸，Nisin，曲酸，响应面，单增李斯特菌Study on composite antibacterial agents for Listeria monocytogenesPAN Lihua，LIU Zhuqing，YU Hui，CHEN Youliang*(College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)Abstract:We had to prevent the growth and proliferation of LM which contaminated the meat to ensure the safety ofchilled meat，as Listeria monocytogenes can grow at 04.We studied the minimum inhibitory concentration(MIC)of different bacteriostatic agents against LM，selected polylysine，Nisin and kojic acid，and found their bestcombination by response surface method.The results showed that the MIC of polylysine，Nisin，kojic acid againstLM was 50g/mL，200g/mL and 6.4mg/mL.The best bacteriostatic effect of LM under the concentration ofpolylysine，Nisin，kojic acid was 20.5g/mL，184.6g/mL and 4.37mg/mL.Key words:polylysine;Nisin;kojic acid;response surface;Listeria monocytogenes中图分类号:TS202.3文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2012)08034405收稿日期:20110812*通讯联系人作者简介:潘利华(1987)，女，硕士，研究方向:食品安全。基金项目:“十一五”国家科技支撑计划(2009BADB095)。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种人畜共患的致病菌，能引起人类脑膜炎、败血症等疾病，尤其对孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能缺陷者具有较高的感染风险1。虽然发病率不高，但致死率(20%30%)2 远高于其他常见食源性病原菌。LM 已被 WHO 列为重点监测的食源性致病菌之一3。冷却肉，是指严格执行检疫制度宰杀后的温热 畜 肉，经 过 各 种 方 法 使 其 温 度 迅 速 降 至04，并在后续的分割加工、流通过程中始终处于04，不超过 7 的冷却链控制下的生鲜肉4。在冷链条件下，酶的活性和大多数腐败微生物的生长受到抑制，与其他微生物不同，LM 在 04 也能生长5。冷却肉要想达到卫生安全的目的，必须阻止冷却肉中污染的 LM 的生长繁殖，而添加防腐剂是一种简单、有效的方法。目前防腐剂分化学合成防腐剂和天然防腐剂，但经过长期的研究发现，一些合成防腐剂有致癌和致突变等问题，因此，开发高效、安全、稳定的天然防腐剂成为防腐剂研究的重要方向67。本实验研究了 聚赖氨酸、Nisin、曲酸、溶菌酶、乳铁蛋白、乳酸钠 6 种抑菌剂对 3 株 LM 的最小抑菌浓度(MIC)，筛选出 3 种抑菌效果较好的抑菌剂，对 3种抑菌剂在肉汤中进行三元二次旋转回归实验设计，通过响应面法找出最佳抑菌剂浓度组合，旨在为其进一步在冷却肉中应用提供科学依据。1材料与方法1.1实验材料单增李斯特菌(EGDA、0013、10403S)浙江大学动物预防医学研究所提供;培养基脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)干粉培养基;聚赖氨酸和 Nisin食品级，浙江银象生物工程有限公司;乳酸钠分析纯，上海展云化工有限公司;曲酸食品级，成都拉克生物工程有限公司;溶菌酶食品级，杭州中香化学有限公司;乳铁蛋白食品级，南京纽瑞氏食品有限公司。1.2实验方法345表 2不同抑菌剂对单增李斯特菌的 MICTable 2MICs of different bacteriostatic agents against LM实验菌株MIC(g/mL)聚赖氨酸Nisin曲酸乳酸钠溶菌酶乳铁蛋白0013502006400 10403S502003200 EGDA502006400 6400注:，抑菌效果几乎没有;，有抑菌效果，但是找不出 MIC。1.2.1最小抑菌浓度(MIC)测定8 1.2.1.1抑菌剂母液的配制及其倍比稀释抑菌剂母液的配制:用无菌蒸馏水配制12.8mg/mL 的 Nisin、溶菌酶、多聚赖氨酸、乳铁蛋白;配制 25.6mg/mL的曲酸和乳酸钠，摇匀，放于冰箱备用。倍比稀释:将抑菌剂母液用无菌水以 12、14、18、116、132、164、1128、1256、1512、11024、12048倍稀释。1.2.1.2菌悬液的制备取细菌 37 摇床培养 1012h。用 BHI 液体培养基调整浓度至 108CFU/mL(OD600=0.15)，将菌液稀释至 107CFU/mL，振荡混匀，4备用。1.2.1.3MIC 的测定将倍比稀释后不同浓度的抑菌液分别加到无菌的 96 孔酶标板中，第 1 至第 11 孔加抑菌液，每孔加 100L，第 12 孔不加抑菌液作对照组，再向每孔中加 100L 制备的菌悬液，密封后置37培养。用酶标仪从 0h 开始每隔 2h 测量菌液的OD630，检测至第 12h。做 ODt 生长曲线，通过观察曲线，以单增李斯特菌不生长的最低浓度为 MIC。1.2.2响应面法优化实验1.2.2.1菌悬液的制备取三株单增李 斯 特 菌(10403S、EGD、0013)37 过夜培养物，调整菌液浓度至 108CFU/mL(OD600=0.15)，将三株单增李斯特菌振荡均匀，4备用。1.2.2.2实验设计按照三元二次回归通用旋转组合设计添加 多聚赖氨酸、Nisin 和曲酸的用量，实验因素水平表见表 1，同时设空白对照组，共 21 组实验。然后取制备好的菌液分装于各组试管，每个试管 50L，最后用 BHI 营养肉汤补足 5mL，初始菌液浓度为 106CFU/mL。将试管于 10 下冷藏放置 5d，从 0d 起，每天每组取 2 个试管进行计数。表 1响应面实验因素水平表Table1Factors and levels of RAS test编码X1聚赖氨酸(g/mL)X2Nisin(g/mL)X3曲酸(mg/mL)+1.682502006+1401604.80251003110401.21.6820001.2.3数据统计与分析所得数据用 SAS 软件(8.2版)进行分析，拟合出模型，并通过降维分析各因素间的交互作用9。2结果与分析2.1不同抑菌剂对单增李斯特菌的 MIC不同抑菌剂对单增李斯特菌的 MIC 见表 2。由表 2 可知，抑菌效果最好的是 聚赖氨酸，对 3 株单增李斯特菌的 MIC 均为 50g/mL，抑菌效果次之的是 Nisin 和曲酸，其 MIC 分别为200 和6400g/mL 以下。而乳酸钠、溶菌酶、乳铁蛋白的抑菌效果不明显。本实验中，虽然 聚赖氨酸和 Nisin 的抑菌效果较好，但是 聚赖氨酸和 Nisin 的价格较高，曲酸价格便宜，因此，选取 聚赖氨酸、Nisin 和曲酸作为回归实验的抑菌剂，以期得到复合抑菌剂。2.2各组 5d 内菌落总数的变化对在 10下冷藏的 21 组 BHI 营养肉汤以 5d 为周期进行菌落总数的检测，其中第 21 组为对照组，结果见表 3。由表 3 可以看出，除第 13 处理组是缓慢增长外，其他处理组单增李斯特菌的生长基本都被抑制，第 8 组是菌数降低最快的一组。对照组明显增加，菌落总数从 106CFU/mL 增长到 109CFU/mL。2.3三元二次回归通用旋转组合设计实验结果三元二次回归通用旋转组合实验设计及第 3d菌落数的对数值如表 4 所示。表 4实验设计及结果Table 4Experimental design and results实验号X1X2X3Y 菌落数(lgCFU/mL)11115.9121114.0031114.6841112.4851114.9561113.3871115.0881112.7091.682004.34101.682003.711101.68204.521201.68202.4813001.6827.2014001.6822.80150004.01160003.57170003.95180003.48190003.04200003.582.3.1回归模型与统计检验用 SAS(8.2 版)软件的 RSREG 过程对表 4 中数据进行多元回归分析。所得二次回归方程:Y=3.6069920.147871X10.492836X21.131975X3+0.135393X21+0.275000X2X10.050177X22+0.020000X3X10.137500X23+0.480023X23。346表 3各组在 10下冷藏 5d 内菌落总数的变化(CFU/mL)Table 3Changes in total bacteria counts of 21 samples stored at 10(CFU/mL)实验号第 0d第 1d第 2d第 3d第 4d第 5d14.2 1066.2 1061.1 1068.1 1056.8 1055.8 10323.1 1061.2 1054.3 1041.0 1044.3 1022.5 1032.9 1065.8 1057.7 1044.8 1043.1 1041.0 10442.5 1061.5 1054.5 1033.0 1021.2 1022.1 1052.3 1062.4 1062.2 1059.0 1044.4 1047.0 10462.4 1064.5 1056.0 1042.4 1034.7 1024.6 1071.9 1066.6 1051.6 1051.2 1056.3 1047.3 10481.4 1067.7 1033.2 1035.0 1027.0 10092.6 1063.6 1056.2 1042.2 1043.7 1031.1 103101.6 1065.6 1041.6 1045.1 1031.3 1031.2 103112.6 1066.4 1051.2 1053.3 1041.7 1041.6 104121.9 1069.0 1044.4 1033.0 1026.0 101.6 10132.8 1067.0 1061.1 1071.6 1071.5 1071.8 107142.3 1063.9 1041.1 1046.3 1024.0 100.8 10152.3 1068.3 1043.7 1044.2 1031.1 1032.4 102162.6 1063.2 1052.4 1043.7 1031.2 1033.3 102172.1 1063.8 1054.5 1034.4 1031.4 1036.5 102182.5 1062.8 1052.1 1032.5 1037.0 1023.9 102192.7 1061.6 1052.8 1033.5 1038.0 1022.9 102202.3 1062.0 1042.5 1033.8 1039.0 1023.5 102212.9 1061.0 1086.6 1081.1 1091.0 1091.0 109为了说明模型的有效性和各因素对抑菌效果影响的重要程度，对二次回归方程模型进行方差分析，结果见表 5。由方差分析表可知，失拟项的 F=0.78，P=0.6029 0.05，表明失拟项不显著，说明未知因子对实验结果干扰很小;回归模型的 F=25.62，P 0.0001，表明回归方程模型极显著，说明该模型与实际情况拟合效果很好，可以正确反映菌落数与 聚赖氨酸、Nisin、曲酸三因素间的关系。为了说明各因素对抑菌效果的贡献大小，对各偏回归系数进行了显著性检验，结果见表 6。表 6 表明，在编码区间内，Nisin、曲酸的添加量对菌落数有极显著影响，聚赖氨酸的添加量对菌落数无显著影响，但 聚赖氨酸和 Nisin 添加量的交互项对菌落数有显著影响。表 5回归模型方差分析表Table 5ANOVA for quadratic model回归自由度(DF)平方和均方和F 值Pr F一次项321.1173130.794563.720.0001平方项33.5982180.135410.860.0017交互项30.7594500.02862.290.1403回归和925.4749810.958425.620.0001失拟项50.484889 0.0969780.780.6029纯误差50.619750 0.123950误差和101.104639 0.1104642.3.2单因子效应分析观察某因子变化对 Y 值的影响，可采用降维分析的方法，将其它因子固定在 0水平，3 个因子的单因子效应方程如下:Y1=3.6069920.147871X1+0.135393X21Y2=3.6069920.492836X20.050177X22Y3=3.6069921.131975X3+0.480023X23根据以上方程，可得到单因子效应曲线如图 1所示。表 6回归系数显著性检验表Table 6Significance test of regression coefficient因素自由度(DF)估计值标准误差t 值P截距13.6069920.13555426.610.0001X110.1478710.0899321.640.1311X210.4928360.0899325.480.0003X311.1319750.08993212.590.0001X1X110.1353930.0875341.550.1530X2X110.2750000.1175072.340.0413X2X210.0501770.0875340.570.5792X3X110.0200000.1175070.170.8682X3X210.1375000.1175071.170.2691X3X310.4800230.0875345.480.0003由图 1 可知，当 X1编码为+0.55，即 聚赖氨酸添加量为 33.2g/mL;X2编码为+1.682，即 Nisin添加量为 200g/mL;X3编码为+1.18，即曲酸添加量为 5.12mg/mL，菌落总数分别为极小值。在取得极小值之前，菌落总数与防腐剂的百分比均为负相关;取得最小值之后，菌落总数与防腐剂的百分比均为正相关。图 1单因子效应曲线Fig.1Effect of single factor on the colony count3472.3.3交互效应分析采用降维分析，令某因素水平值为 0，就可以得到其他两个因素对菌落数的二元二次方程。根据回归方程绘制 聚赖氨酸、Nisin、曲酸 3 个因素对菌落数 Y 影响的响应面图，见图 2图 4。图 2聚赖氨酸和 Nisin 的响应面曲线Fig.2The response surface of polylysine and Nisin图 3聚赖氨酸和曲酸的响应面曲线Fig.3The response surface of polylysine and kojic acid图 4Nisin 和曲酸的响应面曲线Fig.4The response surface of Nisin and kojic acid响应面图可反映响应值对于处理条件改变的敏感性，从另一个方面也说明因素间交互作用的强弱。由图 2图 4 可知 聚赖氨酸和 Nisin 的之间交互作用相对于其他因素之间的交互作用最大，而 聚赖氨酸和曲酸之间的交互作用最小。2.3.4 最佳配比的确定为确定各因素的最佳取值，利用 SAS 软件进行岭脊分析10，根据分析可得菌落总数得到最低水平时 3 种抑菌剂的各自编码值，即X1=0.30，X2=1.41，X3=0.76。换算成实际值，即当聚赖 氨 酸 添 加 量 为 20.5g/mL，Nisin 添 加 量 为184.6g/mL，曲酸添加量 4.37mg/mL 时，单增李斯特菌的对数值可达最小值 1.95，此时抑菌效果最佳。3讨论3.1不同抑菌剂对单增李斯特菌的 MIC本实验中，抑菌效果最好的是 聚赖氨酸，对 3株单增李斯特菌的 MIC 均为 50g/mL，抑菌效果次之的是 Nisin 和曲酸，而乳酸钠、溶菌酶、乳铁蛋白的抑菌效果不明显。倪清艳11 等人采用牛津杯法和平板稀释法测定了 多聚赖氨酸对常见菌的抑菌特性;探讨了其经高温处理后及与其它防腐剂复合后的抑菌特性，结果显示，多聚赖氨酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为40、45、450mg/L;不同温度处理后的抑菌效果基本没有变化。说明其具有较好的热稳定性能。郭良辉12 等人研究了 Nisin 与溶菌酶复合生物保鲜剂对蚌肉的保鲜效果，通过对感官指标、挥发性盐基氮和细菌总数等指标进行考察，从实验结果来看，溶菌酶和Nisin 等对蚌肉的防腐保鲜效果都好于对照组，而且Nisin 与溶菌酶复配后效果更好，从实验中还得出Nisin 具有一定的抑制脂肪酸败的效果。苏国成13 等人针对曲酸对于食品中常见污染菌的抑制作用进行系统研究，确定了曲酸对各种供试菌最小抑菌浓度，即曲酸对大肠杆菌、猪伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌和啤酒酵母菌的 MIC 分别是 0.3%、0.4%、0.2%、0.4%、0.2%和0.5%。国内外关于 聚赖氨酸、Nisin、曲酸、乳酸钠、溶菌酶、乳铁蛋白针对单增李斯特菌的 MIC 的文献报道较少，本实验明确了不同抑菌剂对单增李斯特菌的 MIC。3.2复合抑菌剂对单增李斯特菌的影响加了抑菌剂的各组 BHI 营养肉汤，其微生物的生长基本受到抑制，而未加抑菌剂的对照组，微生物数明显增加，从 106CFU/mL 增长到 109CFU/mL。说明本实验的处理对单增李斯特菌的生长有明显的抑制效果，可为进一步在冷却肉中应用提供科学依据。以菌落总数作为指标来看各抑菌剂的抑菌效果，结果依次是曲酸、Nisin 和 聚赖氨酸。说明在编码区间内，曲酸的添加量对抑菌效果的影响最为显著。1947 年，Mattick 和 Hirsch 证明 Nisin 可抑制许多革兰氏阳性菌14，本实验中，单增李斯特菌为革兰氏阳性菌，Nisin 对其抑制效果达到极显著水平(P 0.01)，这与前人的报道相一致。李凤梅15 采用圆滤纸片法研究曲酸与 聚赖氨酸复合抑菌效果。结果显示，复合后对金黄色葡萄球菌抑菌效果具有协同增效作用。本实验中，从 聚赖氨酸与曲酸的响应曲面图可知，两者的交互作用显著。4结论4.1抑菌效果最好的是 聚赖氨酸，对 3 株单增李斯特菌的 MIC 均为50g/mL，抑菌效果次之的是 Nisin和曲酸，其 MIC 分别为 200 和 6400g/mL 以下。4.2当 聚赖氨酸添加量为 20.5g/mL，Nisin 添加量为184.6g/mL，曲酸添加量4.37mg/mL 时，对数值可到达最小值 1.95，此时抑菌效果为最佳。聚赖氨酸和 Nisin 有交互作用。参考文献 1 Mook P，OBrien SJ，Gillespie IA.Concurrent conditions andhuman Listeriosis，England，19992009J.Emerging InfectiousDiseases，2011，17(1):3843.(下转第 362 页)3623结论本实验对低温酱牛肉在 04、711两个温度贮藏条件下进行各项指标的测定，结果表明:感官评分、硬度、弹性和保水性等都随贮藏时间的变化而下降，且贮藏温度越高变化越明显;在 04和 7 11贮藏到 60d 条件下，低温酱牛肉菌落总数都小于或者接近 8 104cfu/g，达到熟肉制品卫生标准，但 711的贮藏环境下产品的菌落总数明显高于 04，建议产品在 4以下温度贮藏，且温度尽量恒定。表 4不同温度条件下美好酱牛肉 MPN 的变化Table 4Change of Coliform MPN value of mei hao saucebeef under different storage temperature贮藏时间(d)贮藏温度 04(MPN/个/g)贮藏温度 711(MPN/个/g)103320333033403350336033综上所述，低温肉制品的贮藏温度及温度的稳定性对其产品特性影响很大，较高的贮藏温度下样品品质变化比较明显，低温肉制品应尽量在 4以下贮藏;实验是在冬天进行的，夏季更应该注意贮藏温度及其外界环境温度的稳定，消费者在购买产品时应尽量购买生产日期较晚的，接近保质期的产品品质相对要差些，但产品总体是安全的，消费者可以放心购买，由于实验只设置了两个温度梯度和一个产品的样品，下一步将增加温度梯度的设置和样品种类，进一步研究时间和温度对酱牛肉品质的影响。参考文献 1 董寅初.低温肉制品是我国肉制品发展的总趋势 J.肉类研究，1997(1):35.2 白艳红，成亚宁，王玉芬，等.我国低温肉制品研发现状与发展 J.肉类工业，2005(1):285287.3 白艳红.低温熏煮香肠腐败机理及抑菌研究D.呼和浩特:内蒙古农业大学，2005:1617.4 冯德宽.低温肉制品的发展趋势J.肉类工业，1999，5(2):2122.5 白艳红，成亚宁，王玉芬，等.我国低温肉制品研发现状与发展 J.肉类工业，2005(1):285287.6 DYAKES G A，MARSHALL L A，MEISSNER D，et al.Acidtreatment and pastearization affect the shelf life and spoilageecology of vacaumpackaged vinna sausages J.Food Microbiol，1996，13:6974.7 乔晓玲，朱彤，张迎阳.传统酱牛肉制品工业化生产的工艺改进研究 J.肉类研究，2005(1):3336.8 GB 27261996 酱牛肉感官指标 S.9 GB/T 9695.52008 pH 的测定 S.10 GB 5009.32010 水分含量的测定:直接干燥法测定 S.11张伟力.猪肉系水力测定方法J.养猪，2002(3):2526.12 姜松，边兴伟.测试条件对鸡肉火腿肠 TPA 质地参数的影响 J.食品科学，2009，30(1):5458.13 孙彩玲，田纪春.TPA 质构分析模式在食品研究中的应用 J.实验科学与技术，2007，5(2):13.14 GB 4789.22010 食品卫生微生物学检验:菌落总数测定 S.15 GB 4789.32010 食品卫生微生物学检验:大肠菌群测定 S.16MEILGAARD M，CIVILLE G V，CARR B T.Sensoryevaluation techniques M.CRC Press，1999:610.17LoneGrajn，PawDalgaard.Fish spoilage bacterla problemsand solutionsJ.Current poinion in Bioteehnology，2002，13:262266.18 Michael W，Sandra P，Stringer C.The safety of pasteurized in pack chilled meat products with respect to the foodbomebotulism hazard J.Meat Science，2005，70:檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾461475.(上接第 347 页)2 MarcusR.Newinformationaboutpediatricfoodborneinfections:the view from FoodNet J.Current Opinion inPediatrics，2008，20(1):7984.3 吴蜀豫，李迎惠，冉陆，等.中国 2001 年 11 省市食品中李斯特菌污染状况的主动监测 J.中华流行病学杂志，2003，24(8):657659.4 孔保华.畜产品加工 M.北京:科学出版社，2007.5 李波，乔凤，方丽，等.PCR 方法检测食品中单核细胞增生李斯 特 氏 菌J.吉 林 大 学 学 报:医 学 版，2006，32(1):154156.6Patricia L P，Cristina S，Ramon B，et 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