采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析.pdf
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1、532中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2014 年第 26 卷第 6 期耐药性研究J 实用预防医学,2011,18(6):994-9978吕素玲,韦程媛,姚雪婷,等 2010 年广西食品中沙门菌污染状况和血清型分布及耐药谱的研究J 应用预防医学,2012,18(3):137-1409陈玲,张菊梅,杨小鹃,等 南方食品中沙门菌污染调查及分型J 微生物学报,2013,53(12):1326-1332 10席昭雁,张阿峰,吴荣,等 陕西省食品中沙门菌监测研究J 中华疾病控制杂志,2011,15(8):671-673 11陈玉贞,邵坤,关冰,等2003201
2、0 年山东省食源性沙门菌血清分型及药敏分析 J 中国食品卫生杂志,2012,24(1):9-12 12马妮,孙葳,郑洪,等 辽宁省食源性沙门菌血清分布及耐药分析J 中国卫生检验杂志,2013,15(23):3144-3146 13Centers for Disease Control and Prevention Surveillance forfoodborne disease outbreaks-United States,2008J MMWMorb Mortal Wkly ep,2011,60(35):1197-1202 14Analysis of the baseline survey
3、 on the prevalence of Salmonella inholdings with breeding pigs in the EU,2008 Part A:Salmonellaprevalence estimates J EuropeanFoodSafetyAuthorityJournal,2009,7(12):1377-1457 15Boxrud D,Monson T,Stiles T,et al The role,challenges,andsupport of PulseNet laboratories in detecting foodborne diseaseoutbr
4、eaks J Public Health eports,2010,125(Suppl 2):57-62 16梅玲玲,罗芸,叶菊莲,等 浙江省 209 株沙门菌 PFGE 指纹图谱研究J 中国卫生检验杂志,2009,11(19):2478-2482 17王岚,贾华云,张红,等 湖南省食源性德尔卑沙门菌耐药谱及 PFGE 分型研究J 实用预防医学,2013,8(20):915-918论著采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析曾静1,周雪婷1,2,张锡全1,张琳3,张西萌1,魏海燕1,周熙城1,马丹1,倪元颖2(1 北京出入境检验检疫局,北京100026;2 中国农业大
5、学,北京100193;3 河北出入境检验检疫局,河北 石家庄050051)摘要:目的采用高级微生物基因分型系统(DiversiLab 系统)对食品中单核细胞增生李斯特菌进行基因型分析,将分型结果与血清型和菌株的耐药性进行比对研究。方法DiversiLab 系统是基于 rep-PC 原理对微生物进行分型,将分型结果与菌株的血清型进行比较研究,同时对菌株的耐药性与 rep-PC 型别进行研究。结果采用DiversiLab 系统将 46 株单核细胞增生李斯特菌分为 9 个型别 A I。血清型为 1/2a 的分离株以 A 型为主,所测试的 6 株血清型为4b 的分离株均为 H 型;14 株呋喃妥因耐受
6、菌株9 株为 A 型、1 株为 B 型、3 株为 C 型、1 株为 F 型,除 2 株血清型为 3a 外,其余均为 1/2a。结论DiversiLab 系统分析结果,揭示了 46 株从食品中分离的单增细胞增生李斯特菌间的亲缘关系,rep-PC 分型结果与 H 抗原结合位点存在一定联系,呋喃妥因耐受菌株的 DNA 指纹图谱相似度高,与耐药基因有关。关键词:单核细胞增生李斯特菌;DiversiLab 系统;同源性分析;食源性致病菌中图分类号:155;378文献标志码:A文章编号:1004-8456(2014)06-0532-05DOI:10.13590/j cjfh 2014.06.004收稿日期
7、:2014-08-04基金项目:国家质检总局公益性行业科研专项(201110034)作者简介:曾静女研究员研究方向为食品微生物检验方法E-mail:jingzeng_cn163 comTyping Listeria monocytogenes isolated from food by DiversiLab systemZENG Jing,ZHOU Xue-ting,ZHANG Xi-quan,ZHANG Lin,ZHANG Xi-meng,WEI Hai-yan,ZHOU Xi-cheng,MA Dan,NI Yuan-ying(Beijing Entry-Exit Inspection a
8、nd Quarantine Bureau,Beijing 100026,China)Abstract:ObjectiveL.monocytogenes isolates were typed by DiversiLab system The result was compared with theresults of serotype and the antibiotic resistance MethodsThe DiversiLab system was based on the principle of rep-PCesultsThe 46 isolates were classifie
9、d as nine types,type A to I The 1/2a serotype isolates mainly belonged to A typeSix 4b serotype isolates belonged to H type Among 14 nitrofurantoin resistance isolates,nine of them were A type,oneisolate was B type,three isolates were C type,and one isolate was F type Most of the nitrofurantoin resi
10、stance isolates采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析 曾静,等533were 1/2a serotype,except two of them were 3a serotypeConclusionDiversiLab system typing results revealed thegenetic characters and relationship of 46 foodborne L monocytogenes The typing results related to the H sites of serotypeThe similarit
11、y of 14 nitrofurantoin resistance isolates was high,and related to anti-nitrofurantoin resistance genesKey words:Listeria monocytogenes;DiversiLab system;homologous analysis;foodborne pathogen单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)属于李斯特菌属,为革兰氏阳性短杆菌。其在自然界中分布广泛,可以在低温、酸性、高盐的环境中生长1 2,抗逆性强,主要引起人类败血症、脑膜炎、肺炎、流产等多种疾病。其
12、易感人群多为 60 岁以上老人、孕妇、新生儿及患有免疫缺陷症的人群。该菌的致病性强,致死率高达 20%30%3。细菌基因组重复序列 PC 技术(rep-PC)是一种细菌基因组指纹分析方法,通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列,对电泳条带进行比较分析,揭示基因组间的差异4 6。本研究采用基于rep-PC 原 理 的 高 级 微 生 物 基 因 分 型 系 统(DiversiLab)对从食品中分离的 46 株单核细胞增生李斯特菌进行基因分型,并将分型结果与分离株的血清型和耐药性进行比较研究。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源46 株单增细胞增生李斯特菌均分离自食品,是北京出入境检验经法国
13、生物梅里埃有限公司的VITEK 鉴定卡进行鉴定,菌株详细信息见表 1。表 146 株单增细胞增生李斯特菌菌株来源Table 1Origins of 46 L monocytogenes strains菌株来源菌株编号菌株数/株三文鱼BJ-LMO-3,6,7,17,19,20,21,24,25,26,30,32,34,36,38,39,40,41,42,43,44,45,50,51,55,56,58,59,60,61,64,65,6633蚌BJ-LMO-51冻牛筋串BJ-LMO-81鸡肉BJ-LMO-11,37,463猪肉BJ-LMO-181冻肋排BJ-LMO-311金枪鱼头BJ-LMO-351
14、鳌龙虾BJ-LMO-471冻牛肉BJ-LMO-48,542多宝鱼BJ-LMO-491海鲈鱼BJ-LMO-6211.1.2主要仪器与试剂Agilent Bioanalyzer 2100 型 DiversiLab 分型系统(美国 Agilent),PE 9700 型 PC 仪(美国 life)。VITEK 生化鉴定卡、Ultra Clean Microbial DNA提取试剂盒、rep-PC 指纹图谱试剂盒、DNA Chipeagents and Supplies 试剂盒、微流体芯片均购自法国梅里埃。1.2方法1.2.1DNA 提取挑选单个菌落于羊血琼脂培养基上 37 过夜培养。用 MO BIO
15、Ultra Clean Microbial DNA 提取试剂盒提取细菌 DNA。按照说明书推荐步骤提取DNA,DNA 浓度控制在 25 50 ng/l。1.2.2rep-PC 分型以提取的单增细胞增生李斯特氏菌 DNA 为模版,使用 DiversiLab 配套的 rep-PC 试剂盒,按照说明书进行 PC 扩增,PC 循环参数为:94 2 min;94 30 s,50 30 s,70 90 s,35 个循环;72 3 min,反应体积为 25 l。PC 扩增产物注入微流体芯片,放入 DiversiLab 分型系统进行电泳,其自动生成分析报告。DiversiLab 根据 Pearson 相关系数
16、确定菌株间的距离矩阵,用非加权配对算术平均法(UPGMA)建立树状图。2结果2.1单核细胞增生李斯特氏菌 rep-PC 分型结果利用 DiversiLab 系统,相似度系数为 94%时,46 株单核细胞增生李斯特菌被分为 4 个群;相似度系数为 97%时,进一步分为 9 个型别即 A I 型。其中,1 群包括 A 型(21 株)、B 型(3 株)和 C 型(5 株),共 29 株;2 群包括 D 型(1 株)、E 型(1 株)和 F 型(2 株),共 4 株;3 群仅 G 型,1 株;4 群包括H 型(10 株)和 I 型(2 株),共 12 株,见图 1。2.2单核细胞增生李斯特菌 rep-
17、PC 分型结果与血清型根据鞭毛(H)抗原和菌体(O)抗原,单核细胞增生李斯特菌分为 13 个血清型,分别是 1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”7。根据我们实验室以前的研究结果,本研究采用的 46 株单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型包括 1/2a、4b、1/2b、1/2c、3a 和 4d8。对比血清分型和分子分型结果显示,血清分型将 46 株单核细胞增生李斯特菌划分为 6 个血清型,rep-PC 分子分型以相似度系数 97%将其划分为 9 个基因型,相同血清型可被分为不同的基因型。值得注意的是,主要的血清型中,1/2a 以 A 型为主
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