低分子量卡拉胶及其衍生物的生物学活性研究进展.pdf
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1、安徽农业科学,J o u r n a lo f A n h u i 一S e i 2 0 1 0 3 8(5):2 5 8 1-2 5 8 3 2 5 9 8责任编辑常俊香责任校对傅真治低分子量卡拉胶及其衍生物的生物学活性研究进展郭丹1,-,栾晖1,孙藜玮2,牟海津1(1 中国海洋大学食品科学与工程学院。山东青岛2 6 6 0 0 3;2 烟台职业学院食品与生化工程系,山东烟台2 6 5 6 0 0)摘要综述了低分子量卡拉胶及其衍生物在抗肿瘤、抗病毒、抗凝血等方面的生物学活性及其作用机理的研究进展,并阐述了活性片段的构效关系。关键词低分子量卡拉胶;衍生物;分子修饰;生物学活性中图分类号Q 5
2、3 9文献标识码A文章编号0 5 1 7 6 6 1 1(2 0 l o)0 5 0 2 5 8 1 0 3R e s e a r c hP 瑚删伽B i o l o g i c a lA c t i v i t i e so fL o wM o l e c u l a rW e i g h tC a r r a g e e n a na n dI t sD e r i v a t i v e sG U OD a ne ta l(C o l l e g eo fF o o dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g,O c e a nU n i v e r
3、 s i t yo fC h i n a,Q i n g d a o,S h a n d o n g2 6 6 0 0 3)A b s t r a c tT h er e s e a r c hp r o g r e s so nb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fl o wm o l e c u l a rw e i g h tc a r r a g e e n a na n di t sd e r i v a t i v e si na n t i t u m o r,a n t i v i r a l,a n t i e o a g u l
4、a t i o ne t ca n dt h e i ra c t i o nm e c h a n i s mw e r es u m m a r i z e d T h es t r u c t u r e-a c t i v i t yr e l a t i o n s h i po ft h ea c t i v ef r a g m e n tw a rd e s c r i b e d K e yw o r d sL o wm o l e c u l a rw e i g h tc a r r a g e e n a n;D e r i v a t i v e s;M o l e
5、c u l a rm o d i f i c a t i o n;B i o l o g i c a la c t i v i t yl 低分子量卡拉胶及其衍生物的制备1 1 卡拉胶的降解技术卡拉胶(C a r r a g e e n a n)是存在于某些红藻细胞壁中的一种硫酸半乳聚糖。各种类型的卡拉胶均含有1,3-1 3-D 一半乳糖和l,4 一O t D 半乳糖交替连接形成的骨架结构,但可根据半乳糖中是否含有内醚以及半乳糖上硫酸基的数量和连接位置不同将其区分为K-、“-、卜、0 一、入一、8-、v-7 种卡拉胶类型。常见的卡拉胶一般为K-、L-或入型卡拉胶。卡拉胶是一种高分子量化合物,因其
6、相对分子质量过大而应用受到限制。降解后卡拉胶的生物利用度和生物活性均有所提高。目前,卡拉胶的降解方法主要有酸降解、酶降解和超声波降解等。1 1 1 酸降解。酸性溶液可使多糖中的糖苷键断裂,将多糖降解为低分子片段。M y s l a b o d s k i 等通过控制不同的温度和p H 值,用酸水解K 一卡拉胶,得到了不同分子量的K 卡拉胶。H j e r d e 等在稀酸中分别加入诱导物L i C I 或“I 对K 卡拉胶进行降解,得到了分子量分布较均一的K 一卡拉胶拉1。王长云等用稀酸水解法对K-卡拉胶进行降解,经超滤分级、凝胶柱层析分离,获得了8 个卡拉胶低聚糖及寡糖组分日1;用高效凝胶渗
7、透色谱法(H P G P C)测得其平均分子量M w 在l7 5 0 一1 15 0 0(平均聚合度D P 4 2 8)。相对其他降解方法,酸降解不易控制反应条件,且易引起多糖结构破坏。1 1 2 酶降解。酶降解具有专一性、高效性、降解条件和过程易于控制、无副反应等优点,目前其应用日益广泛。由于特定的降解酶只作用于特定的糖苷键,不但可以得到分子量比较均一的降解产物,而且对多糖的主体结构也不会产生影响。卡拉胶酶存在于海洋软体动物、棘皮动物和海洋微生物中。目前,人们已在假单胞菌(P s e u d o m o n a sc a r r a g e e n o v o r a)、噬纤维菌(C y t
8、 o p h a g a)、别单胞菌(A l t e r o m o n a sc a r r a g e e n o t 枷m)、弧菌(V i b r i o)及某些未鉴定菌种中发现了卡拉胶酶H 娟J。基金项目国家自然科学基金项目(4 0 5 0 6 0 2 7);山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(2 0 0 5 B S 0 2 0 1 5);国家科技支撑计划(2 0 0 7 B A D 6 2 1 3 0 3)。作者简介郭丹(1 9 8 1 一),女,辽宁铁岭人,助教,从事应用微生物教学工作。通讯作者,副教授,E m a i l:m o u s u n O U C e d u c n
9、。收稿日期2 0 0 9-1 0-2 7根据酶解底物的专一性。可将卡拉胶酶分为K 卡拉胶酶、卜卡拉胶酶、入一卡拉胶酶等。据现有资料来看,卡拉胶酶的作用机制是:”卡拉胶酶专一性作用于K 卡拉胶的B(1,4)糖苷键得到K 一新卡拉二糖和K 新卡拉四糖;L 卡拉胶酶专一性作用于L 一卡拉胶得到L 一新卡拉二糖和L 新卡拉四糖;入一卡拉胶酶的作用机制尚不清楚o。M o u 等哺1 使用酶解的方式对K-卡拉胶进行了降解,M C A-2 经发酵培养后,将酶液以一定比例加入卡拉胶溶液中,摇床培养后将反应溶液离心,上清液旋转蒸发,用乙醇将水溶性卡拉胶成分沉淀出来,经超滤、冻干后得到低分子量的卡拉胶降解产物。目
10、前,卡拉胶酶的种类和商业供给都受到一定限制,此法尚无法大规模应用,筛选高效产酶微生物是解决此类问题的有效方法。1 1 3 超声波降解。超声波降解易于控制反应条件,便于得到较窄分子量分布范围的产物。T o s h i h a r uY a m a d a 等使用超声波方法对K 一和k 一卡拉胶进行了降解。对加入了硫酸亚铁、抗坏血酸和E D T A 的卡拉胶水溶液进行超声波处理后,通过离子交换柱和膜透析,经真空浓缩冻干后,得到低分子量的卡拉胶降解产物一1。Z h o u 等采用密闭微波降解法对入一卡拉胶进行了降解,共获得了5 个不同分子量(6 5 0、2 4 0、1 4 0、1 5、9 3k D
11、a)的降解产物。1 2 卡拉胶的化学修饰1 2 1硫酸酯化。常见的硫酸酯化方法有氯磺酸-吡啶法“-1 2 、甲酰胺一氯磺酸一吡啶法m 1、甲酰胺一氯磺酸法等。陈方将吡啶在冰水浴下强烈搅拌,缓慢滴加氯磺酸,使之反应形成酯化试剂,再加入K-卡拉胶,置于一定温度反应后,真空浓缩除去吡啶,继而真空浓缩、冻干得硫酸化K 卡拉胶产品。O p o k u 等2 1 使用氯磺酸-吡啶法对K 卡拉胶进行了硫酸化,经乙醇沉淀、低压冻干后得到产物,在C _ 4 硫酸基基础上于C-6 位置再引入一个硫酸基形成4,6 二硫酸化合物。Z an、l g a 等 使用五氧化二磷将反应得到的F R D-8 半乳 万方数据安徽农
12、业科学2 0 1 0 年糖片段在真空中干燥,然后将其溶解于甲酰胺中。再将上述液体逐滴加入氯磺酸与无水吡啶的混合物中,反应结束后用乙醇沉淀、透析、浓缩通过G 1 0 交联葡聚糖柱得到产物。袁华茂向卡拉胶寡糖混合物中加入N,N 二甲基甲酰胺,搅拌使卡拉胶寡糖分散于溶剂中,加入S O,-D M F 混合物,反应后经减压浓缩、无水乙醇沉淀、冷冻干燥后得产物。1 2 2 酰化。抗凝血活性被认为是硫酸多糖在治疗艾滋病过程中通常表现出的副作用,将酰基引入低分子量卡拉胶中有利于降低其抗凝血活性和溶血等其他毒副作用。一般先引入不同长度的直链羧酸,再将其他没有被取代的羟基硫酸化。Y a m a d a 等将入-和
13、K-卡拉胶的超声波降解产物在二甲胺基吡啶和三丁胺的催化下与羧酸酐酰化,酰化产物在D M F中用吡啶一三氧化硫进一步硫酸酯化,结果发现低丁酰化或低己酰化的硫酸化产物具有较硫酸化葡聚糖更高的活性,同时取代度为1 1 1 5 的入一丁酰化卡拉胶衍生物的抗凝血活性比硫酸化葡聚糖低得多,说明酰化可显著降低硫酸多糖的抗凝血活性一o。由表1 可知,低分子量卡拉胶可以通过不同的酸酐进行酰化,得到不同类别的酰基化产物;也可以通过控制不同的酰化试剂及酰化条件,得到不同程度的酰基化产物。1 2 3 磷酸酯化。袁华茂4 1 将吡啶于冰水浴下滴人。再滴入含有卡拉胶寡糖混合物的甲酰胺溶液,反应后用饱和B a(O H):溶
14、液除去反应液中的沉淀,蒸馏水洗涤沉淀,合并滤液与洗液,减压浓缩,经有机溶剂沉淀、冷冻干燥后得到磷酸酯化产物。表1 常见酰化方法及产物T a b l e1C o n u n o na c y l a t i o nm e t h o da n dp r o d u c t s酰酐反应体系溶剂酰化程度酰化产物A c y la n l I y d r i d eR e a c t i o ns o l v e n tA c y l a t i o nd e g r e eA c y l a t i o np r o d u c t乙酸酐A c e t i ca n h y d r i d eN N
15、一二甲基甲酰胺低度低度乙酰化K 卡拉胶寡糖”引乙酸酐A c e t i ca n h y d r i d e甲酰胺高度高度乙酰化K 卡托胶寡糖。卅乙酸酐A c e t i ca n h y d r i d e毗啶低度低度乙酰化K 卡拉胶寡糖”o乙酸酐A c e t i ca n h y d r i d e毗啶、四丁基溴化铵或吡啶、1 8 冠醚6高度高度乙酰化低分子量K-卡拉胶副乙酸酐A c e t i ca n h y d r i d e吡啶,同时离子交换高度高度乙酰化高分子量K-卡拉胶”纠邻苯二甲酸酐P h t h a l i ca n h y d r i d eN,N 二甲基甲酰胺邻苯二甲
16、酰基化K 一卡拉胶寡糖“6】琥珀酸酐A n h y d r i d eN,N 一二甲基甲酰胺O-琥珀酰基化K 一卡拉胶寡糖“”丁酸酐B u l【y r i ca n h y d r i d eD M F0-丁酰化K 一卡拉胶寡糖9 己酸酐C a p r o i ca n h y d r i d eD M F0 一己酰化K 卡托胶寡糖”j十二烷酸酐D o d e c a n o i ca n h y d r i d eD M F0-十二烷酰基化旷忙拉胶寡糖旧12 卡拉胶及其衍生物的生物活性近年来的研究发现,硫酸酯化多糖往往具有独特的生物活性。卡拉胶作为一种结构独特的硫酸多糖,也被证明在抗肿瘤、抗
17、病毒、抗凝血、抗氧化等方面具有较理想的生物活性。2 1 抗肿瘤活性卡拉胶可通过提高机体免疫系统的功能和巨噬细胞的吞噬能力等来发挥抗癌作用。袁华茂4 1 发现卡拉胶寡糖可以明显抑制小鼠体内肉瘤S 一1 8 0 的生长转移,促进巨噬细胞的吞噬作用,促进脾细胞分泌抗体和脾淋巴细胞增殖,提高N K 细胞的活性以及血清中白细胞介素I L-2 和T N F a 的水平。M o u 等通过酶解方法获得的硫含量为1 5 1 的卡拉胶低聚糖对小鼠S 1 8 0 具有明显的抗肿瘤活性,其对巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均较高H。O s u m i 等利用海洋微生物A r t h r o b a c 衙s p S-2
18、2 提取的酶降解紫菜聚糖,获得的硫酸化二糖O S P l 对M e t h-A 纤维肉瘤、E h r l i c h 腹水瘤细胞具有明显的抑瘤活性,且腹膜注射可显著提高巨噬细胞的吞噬能力8。Z h o u 等对入一卡拉胶进行了降解,获得了不同分子量的降解产物,分别对其体内抗肿瘤活性及其对化疗药物抗肿瘤活性的影响进行了研究,并测定了各组试验小鼠的部分免疫指标。证实了入卡拉胶具有显著的体内抗肿瘤活性和免疫调节活性,同时能增强化疗药物的抗肿瘤能力。并有效抵抗其导致的免疫功能低下。卡拉胶还能选择性地抑制某些生长调节因子。如P D G F。b F G F 和T G F-B l,这可能也是其抗肿瘤机制的重
19、要影响因素。例如 L-卡拉胶是碱性成纤维细胞生长因子(b F G F)的特异性抑制剂。而b F G F 具有明显的促血管生长作用,已被证实是肿瘤血管生成和肿瘤浸润的重要因子,对肿瘤细胞的增殖和转移具有促进作用【。2 2 抗病毒活性硫酸半乳聚糖能够抑制多种被膜病毒,如艾滋病毒、疱疹病毒、囊膜病毒、沙粒病毒、粘液病毒和棒状病毒等mJ。以抗H I V l 为例,I-I I V-1 病毒引起细胞病变是由于H I V-I外壳糖蛋白g p l 2 0 带正电荷的V 3 区域与T 淋巴细胞表面H I V l 受体分子C I)4 特异结合,导致细胞感染H I V-1 病毒。感染H I V 1 的细胞与未感染H
20、 I V 1 的细胞表面结合,形成合胞体,使更多的细胞感染H I V-l 病毒。如果有带负电荷的硫酸化多糖存在,则硫酸多糖会与V 3 区域结合,避免病毒与细胞结合。同时,硫酸化多糖也可以有效抑制合胞体的形成【2。“。M E RD u a r t e 等分别在病毒吸附期前、病毒吸附期后、病毒吸附期前和病毒吸附期后向含有病毒的V e t o 细胞中加入寡糖溶液,发现只有在病毒吸附过程中加入卡拉胶寡糖,才能发挥其抗病毒作用旧-。2 3 抗凝血活性卡拉胶具有与肝素相似的抗凝血活性。G l o r i aO p o k u 等使用氯磺酸一吡啶法对K-卡拉胶进行了硫酸化“。柠檬酸盐抗凝血浆双倍凝血时间试验
21、表明,硫酸化卡拉胶表现出3 0 倍高的抗凝活性。凝血酶原激活剂t-P A 和u P A 对纤溶酶原的体外激活作用试验结果表明,C-6 硫酸化的K-卡拉胶激活作用的初速度比对照增加了3 倍;而未修饰的卡拉胶和普通肝素作用较小。2 4 抗氧化活性袁华茂对高度硫酸酯化、低度和高度乙 万方数据3 8 卷5 期郭丹等低分子量卡拉胶及其衍生物的生物学活性研究进展2 5 8 3酰化、部分磷酸酯化的卡拉胶寡糖衍生物的抗氧化活性进行了研究,结果表明硫酸化和乙酰化衍生物对超氧阴离子的清除作用和还原能力、磷酸化衍生物和低度乙酰化衍生物对羟自由基的清除作用、磷酸化衍生物对有机自由基的清除作用和金属螯合能力、硫酸化和磷
22、酸化衍生物的总还原能力均高于卡拉胶寡糖。同时,卡拉胶寡糖及其不同衍生物均能显著保护胸腺淋巴细胞免受长波紫外线和过氧化氢的损伤具有良好的抗氧化作用“。2 5 抗辐射活性李翊等采用6M V X 直线加速器一次全身照射B A L B c 小鼠,3 个卡拉胶寡糖组照射前连续1 4d 和照射后继续给药7d。结果发现卡拉胶寡糖组小鼠3 0d 存活率比照射对照组提高了7 5 一9 0;而且卡拉胶寡糖可加速小鼠外周血白细胞的恢复,明显提高其胸腺指数和脾脏指数,激活脾脏N K 细胞的杀伤活性增强巨噬细胞的吞噬功能1。2 6 其他活性作为一种膳食纤维,卡拉胶可降低血清低密度脂蛋白(L D L)、抑制胆固醇的吸收p
23、 1(除了直接影响胆固醇吸收外,卡拉胶还可通过形成凝胶吸附胆酸。而胆酸的合成需要消耗胆固醇)。陈海敏等将试验得到的一种k 卡拉胶寡糖用于制备血管增生抑制剂啪1。入卡拉胶寡糖由于具有重复的d-(1 4)一D 一半乳吡喃糖B 一(1-3)D 半乳吡喃糖的二糖单元骨架结构,且其结构单元内含有高硫酸基团,因此可以在肿瘤、炎症、糖尿病等疾病引起的血管增生的防治中用作血管增生抑制剂,抑制各种疾病引起的血管增生。3 活性构效关系研究表明,卡拉胶及其低聚糖的生物活性与其分子量、硫酸酯化程度、结构类型及空间结构等密切相关。3 1 分子量对卡拉胶生理活性的影响天然卡拉胶多糖因分子量大、粘度高、溶解度低等特点而影响
24、其f 临床应用价值。若静脉注射未降解的卡拉胶,则其会与纤维蛋白形成不溶性复合物而难以被机体吸收。而经降解后得到的低分子量卡拉胶静脉注射后可与血纤维蛋白生成可溶性复合物,有利于机体吸收,同时其毒性也大大降低忙”。师然新等利用H:0:降解角叉菜,得到不同分子量的角叉菜多糖,通过试验研究其对小鼠肝癌H-2 2 的抗肿瘤作用,发现分子量是影响角叉菜多糖抗肿瘤作用的重要因素:适当减小分子量可提高其抑瘤率,但分子量太小又会使其抑瘤率迅速降低J。3 2 硫酸酯化程度对卡拉胶生理活性的影响卡拉胶中硫酸根的数目和位置对其生物活性具有显著影响。C a r l u c c i 等研究发现,卡拉胶的抗H S V 病毒
25、活性与其n D 一半乳糖2,6-二硫酸残基的数量有关嘲】。若去掉卡拉胶多糖上的硫酸根,则卡拉胶同时失去抑制H S V 病毒复制的作用。卡拉胶多糖的抗H S V 活性还随其仅一D 一半乳糖6 硫酸和2,6 一二硫酸单位环化成3,6 一内醚aD 半乳糖和3,6 内醚-a 一半乳糖2-硫酸残基而降低。3 3 结构类型对卡拉胶生理活性的影响由于x 一卡拉胶的硫酸基团含量较高,其抗凝血效果高于K-卡拉胶旧。“。此外L-卡拉胶可轻微阻止由血小板A D P 引起的血小板凝集现象,而入-卡拉胶则无此作用。C a d u c e i 等从红藻G i g a r t i n as k o t u b e r g
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