合成生物学 非特异性过加氧酶(UPO)的研究综述.pdf

Synthetic Biology Journal 2022,3(6)12351249特约评述佛学2022 年第 3 卷第 6 期 I DOI：10.12211/2096-8280.2022-028非特异性过加氧酶(UPO)的研究综述赖铭元，韦健，许建和，郁惠蕾(华东理工大学，生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)摘要：未活化的CH键选择性插入活性氧是目前有机合成面临的最具挑战性之一。真菌非特异性过加氧酶(UPO)是一类高度糖基化的硫代血红素酶，催化的反应包括正构烷煌中未活化的CH键的羟基化、烯煌和芳煌 的环氧化、含杂原子(N、S)化合物的氧化、乙醛裂解、M脱烷基化、脱酰化和酚类的单电子氧化。UP0以 凡。2为氧供体与电子受体，不需要任何辅因子，是目前最具发展潜力的氧化酶之一。然而，UP0的异源表达困难 与选择性差的问题仍限制着UP0的发展。近两年，通过信号肽改造或更换的方法在UP0的异源表达方面取得了 重要突破，对UP0结构功能关系的深入研究以及蛋白结构预测算法的发展也将助力UP0的分子改造，为解决 UP0选择性差的问题奠定基础。本文聚焦于UP0的异源表达、选择性问题与Hz。2原位再生，综述了 UP0的最新 发展以及存在的技术瓶颈，并对解决这些瓶颈问题的方案做出展望。关键词：非特异性过加氧酶；未活化cH键；氧化反应；异源表达；选择性中图分类号：Q814 文献标志码：AReview of research on unspecific peroxygenases(UPOs)LAI Mingyuan,WEI Jian,XU Jianhe,YU Huilei(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)Abstract：The selective insertion of oxygen species through unactivated C一H bonds is one of the most challenging tasks in organic synthesis.Fungal unspecific peroxygenases(UPOs)are a class of highly glycosylated thioheme enzymes that catalyze reactions including hydroxylation of unactivated C一H bonds in n-alkanes,epoxidation of alkenes and aromatics,oxidation of heteroatom(N,S)compounds,ether cleavage,A-dealkylation,deacylation and one-electron oxidation of phenols.As one of the most promising oxidases in synthetic chemistry,UPOs use H2O2 as the oxygen donor and the electron acceptor,and do not require cofactors other than heme.This paper reviews the classification and development process of UPOs,and focuses on the heterologous expression,selectivity engineering and H2O2 in situ regeneration of UPOs.Since the first discovery of UPOs from Agrocybe aegerita in 2004,UPOs have attracted much attention due to the advantages described above.However,the difficulties of heterologous expression and poor selectivity of UPOs still limit their development.The difficulty of heterologous expression makes it hard to收稿日期：2022-05-16修回日期：2022-07-07基金项目：国家重点研发计戈1K2019YFA0905000)引用本文：赖铭元，韦健，许建和，郁惠蕾.非特异性过加氧酶(UPO)的研究综述J.合成生物学，2022,3(6)：1235-1249Citation：LAI Mingyuan,WEI Jian,XU Jianhe,YU Huilei.Review of research on unspecific peroxygenases(UPOs)J.Synthetic Biology Journal,2022,3(6):1235-12491236合成生物学第3卷mine new variants of UPOs,and native UPOs are difficult to be characterized and applied in biocatalysis due to the slow growth rate of their hosts.In the past two years,important breakthroughs have been made in the heterologous expression of UPOs through the modification or replacement of signal peptides,revealing the important role of signal peptides in this process.However,the specific role of signal peptides in the secretory expression and three-dimensional structure formation of UPOs remain elusive.With the in-depth research on the mechanism of signal peptides affecting the heterologous expression of UPOs and the development of artificial intelligence(AI)algorithms,the combination of genome mining and signal peptide prediction will be the key for discovering new UPOs.The poor selectivity of UPOs also hinders the development and application of UPOs.This paper reviews different types of reactions that UPOs catalyze,and reveals the problem that UPOs have broad substrate range but poor selectivity.In-depth research on the structure-function relationship of UPOs and the development of protein structure prediction algorithms will help the engineering of UPOs and lay a foundation for solving the problem of poor substrate selectivity.This paper also compares several methods for the in situ regeneration of H2O2,and concluded that the multi-enzyme cascade method is the most economical and practical method for the in situ regeneration of H2O2.Heterologous expression Change hostA Signal peptide modification or replacementPoor selectivity Molecular modificationIn situ regeneration of H2O2 Photochemical method Electrochemical methodA Enzymatic cascadeKeywords：unspecific peroxygenase(UPO);unactivated C一H bond;oxidation reaction;heterologous expression;selectivity1引言氧化还原酶催化的氧化还原反应为绝大多数 的生物提供了生长代谢所必需的能量与物质，而 这些氧化还原酶也为有机合成提供了新选择。相 较于以昂贵的过渡金属作为催化剂插入活性氧，酶催化反应具有立体选择性和区域选择性高、绿 色环保等优点。根据催化的反应类型以及辅因子依赖型，氧 化还原酶可分为氧化酶(EC1.X.3.X)、过氧化物酶(EC1.1L1.X)、过加氧酶(EC 1.11.2.1)、单加氧酶(EC 1.13.12.x)与双加氧酶(EC 1.13.11.EC 1.14.11.x、EC 1.14.12.x)E1这些氧化还原酶通常 以血红素、黄素或者是金属离子作为辅因子，其 依赖的电子受体也有所不同。氧化酶中，含铜氧 化酶以作为电子受体，黄素氧化酶以与Fe、酿等氧化剂作为电子受体；含血红素的过氧化物 酶与过加氧酶以H2O2为电子受体；单加氧酶与双 加氧酶以作为电子受体(表1)。与过氧化物 酶不同，过加氧酶以H2O2为电子受体与氧供体，第 3 卷 1237表1氧化还原酶分类Tab.1 Classification of oxidoreductases(according to the webpage Enzyme Nomenclature of theNC-IUBMB https:/iubmb.qmul.ac.uk/enzyme/EC 1/)名称编号辅因子电子受体催化作用氧化酶EC 1.x 3.x金属离子(Cu等)o2将电子从底物或辅因子转移到分子氧上黄素C)2、Fe3+、酸等过氧化物酶EC 1.11.1.x血红素h2o2催化两个电子从底物转移到h2o2过加氧酶EC 1.11.2.1血红素h2o2催化氧原子从H2O2转移到底物上单加氧酶EC 1.13.12.x血红素、黄素等催化1个氧原子从转移到底物中双加氧酶EC 1.13.11.x黄素、金属离子等O2催化2个氧原子从转移到底物中EC 1.14.11.xEC 1.14.12.x选择性地将H2O2上的氧加到底物上，而过氧化物 酶基本不催化底物加氧反应例外：氯过氧化物 酶(chloride peroxidase,EC 1.11.1.10)具有过加 氧酶活性。选择性氧化未活化的CH键是有机合成梦寐 以求的反应之一，目前罕有化学法能实现该步 骤。细胞色素P450单加氧酶(P450s)是少数能催 化未活化CH键氧化的氧化酶之一卬5,但是存 在着稳定性差、底物负载量低及辅因子依赖等缺 点，导致其极难应用于工业生产。非特异性过 加 氧 酶(unspecific peroxygenase,UPO)的蛋白 结构与P450s相似，都含有半胱氨酸配体配位的血 红素辅基，这也使得UP0与P450s的催化机制类 似。与P450s相比，UPO不催化氧分子的还原活 化，而是直接利用过氧化氢形成具有催化活性的 氧-铁基阳离子自由基配合物，因此，UPO不需要 昂贵的NAD(P)H提供还原力。总而言之，UPO 理论上具有与P450s同样的催化特性，而不依赖于 烟酰胺辅因子的还原力和复杂的电子传递链，因 此，UPO具有很好的应用潜力。2 UP0的发现和分类upo是一类高度糖基化的硫代血红素酶，归 类于血红素硫酸盐过加氧酶(HTP)超家族。同亚类的还有5种酶，即髓过氧化物酶(EC 1.11.2.2,CF+H2O2+H+=HC10+旦0)、脂肪 酸过加氧酶(EC 1.11.2.3,fatty acid+H2O2-3-or 2-hydroxy fatty acid+H20):10 植物种子过加氧酶(EC 1.11.2.4,RXH+R200H-ROH+RH)E11 3-甲基-L-酪氨酸酶过加氧酶(EC1.H.2.5,3-methyl-L-tyrosine+H2O23-hydroxy-5-methyl-L-tyrosine+旦0)和L-酪氨酸酶过加氧酶(ECI.11.2.6,L-tyrosine+H2O2-L-dopa+H2O)13o2004 年,Ullrich 等14首次于 Agrocybe aegerita(一种食用蘑菇)中发现UPO,其表现出 与氯过氧化物酶(/CPO).力相似的催化活性，因此将其命名为卤素过加氧酶(haloperoxidase peroxygenase)18o进一步研究发现该卤素过加氧 酶基本无法对底物进行卤化，但是对芳香族底物 具有明显的环氧化与羟化作用，因此改名为 AaeAPO(agrocybe aegerita aromatic peroxygenase)加。随着对其催化底物谱的测定，发现AoeAPO的活性 并不局限于芳香族化合物，而对杂环和脂肪族底物 都具有过加氧酶活性。因此，在2011年，过氧化氢 依赖型单加氧酶最终被命名为非特异性过加氧酶(unspecific peroxygenase,UPO,EC 1.11.2.1.),已发现这类酶催化的反应包括羟基化、环氧化、脱烷基化、芳构化、硫氧化、氮氧化、脱氯和卤 化物氧化：20o目前发现的UPO基本来源于真菌，NCBI等数 据库中收录的UPO序列超过4000条。Muniba Faiza等21搭建了一个在线数据库(),包含从800多个真菌基 因组中挖掘的1948个过加氧酶编码蛋白序列。这 个数据库提供了关于每个序列的分类和基序等信 息，并具有对UPO序列分析的同源性搜索等功能。根据UPO的蛋白质大小，目前将其分为两类：短链过加氧酶(I类)与长链过加氧酶(II类)。1238合成生物学第3卷短链过加氧酶平均大小在29 kDa左右，长链过加 氧酶平均大小在44 kDa左右。这两类UPO在活性 位点上也存在差异，短链过加氧酶以一个保守的 组氨酸作为电荷稳定剂，而在长链过加氧酶中，作为电荷稳定剂的则是一个精氨酸。I类和II类 的 UPO 中分别存在-PCP-EHD-E 和-PCP-EGD-R-E 的保守氨基酸，在不属于AoeUPO亚群的长链UPO 中，其保守序列可能有所偏差。3 UPO的异源表达由于UPO的高度糖基化，它们易溶于水且在 水环境中相当稳定，但同时也说明了 UPO需要进 行复杂的修饰，其中包括糖基化、二硫键桥的形 成、N端和C端序列的切割以及辅基的结合 这导致异源功能性表达成为阻碍UPO研究和应用 的瓶颈。目前解决UPO异源表达问题往往需要更换合 适的异源表达宿主，或对UPO特别是其信号肽进 行分子改造。原核宿主并不适合UPO的功能性表达。Zong 等2报道了快CPO在大肠杆菌中的表达，发现 非糖基化酶分泌到外周质中，超过90%的/CPO 为包涵体，只有在高压下(207 MPa)经过冗长的 重新折叠过程才能获得活性全酶，收率仅为5%,这说明了恢复糖基化酶活性的难度之大。Carro等对野生型”“UPO进行密码子优化，使 用乳糖自诱导培养基进行诱导培养，成功在大肠 杆菌中表达”“UPO。Linde等匐在大肠杆菌中 异源表达来源于 Collariella virescens 和 Daldinia caldariorum的UPO。但是大肠杆菌无法对UPO进 行糖基化修饰，而糖基化对UPO活性影响很大，同时还会影响UPO的水溶性与pH稳定性。MroUPO 去糖基化之后，对 NBD(5-nitro-l,3-benzodioxole,5-硝基-1,3-苯并二氧戊环)的氧化 活性下降约80%,而Cg/UPO则是对NBD完全失 去氧化活性，TteUPO和MUPO对NBD的氧化活 性也严重受损。所以，UPO作为一种高度糖基 化的酶，要研究以大肠杆菌为宿主表达UPO,首 先要研究如何恢复非糖基化UPO的活性。近年来的研究主要集中于构建真菌异源表达 系统。2014年，Molina等通过5轮进化，引入 9个突变(其中5个突变在信号肽，其余4个在 UPO蛋白)，AaeUPO突变进化体PADA-I成功在 酿酒酵母中实现功能性表达，总活性提高了 3250 倍，并首次提出信号肽对UPO的异源表达至关重 要。Molina等又以毕赤酵母为表达系统成功表达 了 PADA-I,使毕赤酵母表达的AoeUPO蛋白含量 从最初的0.007 mg/L显著提高到217 mg/L。米曲霉Aspergillus oryzae)也是较为成熟的 异源表达模式菌株。与酵母相比，米曲霉与UPO 部分原宿主(霉菌)亲缘关系更加接近，因此，米曲霉也被尝试应用于UPO的异源表达。Novezymes公司成功在米曲霉中异源表达来源于 Coprinopsis cinerea 的 CciUPO 32-33：和来源于 Humicola insolens 的 HinUPO 34-35。可喜的是，2021年，Pascal Pullmann等，加 通过更换信号肽与启动子的方法成功在酿酒酵母 与毕赤酵母表达了 TYeUPO等7条UPO。同年，Miguel Alcalde等旧 将PabUPO信号肽更换为 PADA-I的信号肽，并对PHUPO进行分子改造，成功将PqOUPO在酿酒酵母中的表达量提高至 14.1 mg/Lo这些进展证明了信号肽对UPO的异源 表达具有的重要影响，为突破UPO异源表达这一 瓶颈作出了重要贡献，为UPO的深入研究奠定了 重要基础。同时，无细胞蛋白表达系统也为难以 异源表达的UPO的表达提供了新选择。2022年，Schramm等,以真菌裂解物为原料，在无细胞体 系中成功合成了野生型AoeUPO。目前已成功异源 表达的UPO见表2。4 UPO的蛋白结构与催化机制解析目前已报道的UPO的蛋白结构共有3种。2013年，Piontek等42报道了第一个来源于 Agrocybe aegerita的非特异性过加氧酶的晶体结构(AaeUPO,PDB 2yor)o 2016 年，该团队解析了 来源于Marasmius rotula的 MroUPO的 晶体结构(PDB 5FUJ)o 2021 年，Laura Rotilio 等40解析了 来源于 Hypoxylon sp.EC38 的 UPO(H卯UPO,PDB 7olr)的晶体结构。UPO的活性位点含有半胱氨酸配体配位的血第 3 卷 1239表2已成功异源表达的UPOTab.2 UPO that have been successfully heterologously expressedUPO来源异源表达宿主方法MraUPOM.rotulaE.coli原序列，自诱导培养基阿DcaVPOD.caldariorumE.coli原序列,CvzUPOC.virescensE.coli原序列，HinUPOH.ins o lensAspergillus oryzae原序列网CczUPOC.cine re aAspergillus oryzae原序列阳PvzUPOP.virgatulaAspergillus oryzae原序列明如UPOT.hyrcaniaeAspergillus oryzae原序列网皿UPOC.fumagoAspergillus niger原序列网AaeUPO(wild-type)A.aegerita无细胞无细胞蛋白表达系统网AaeUPO(PADAI)A.aegeritaS.cerevisiae&P,pastoris信号肽改造即3日MwUPOM.rotulaS.cerevisiae&P,pastoris更换信号肽CgZUPOC.globosumS.cerevisiae&P,pastoris更换信号肽MtMJPOM.thermophilaS.cerevisiae&P,pastoris更换信号肽国36TteUPOT.terrestrisS.cerevisiae&P,pastoris更换信号肽36PabUPOP.aberdarensisS.Cerevisiae&P,pastoris更换信号肽sMfeUPOM.fergusiiP.pastoris更换信号肽的MhiUPOM.hinnuleaP.pastoris更换信号肽的DcaUPOD.caldariorumP.pastoris更换信号肽.HspUPOHypoxylon spP.pastoris原序列一AniUPOAspergillus nigerP.pastoris信号肽预测CabUPO 1C.aberdarensisP.pastoris信号肽预测即CabUPO 2C.aberdarensisP.pastoris信号肽预测阳红素吓咻环。半胱氨酸与两个侧翼脯氨酸残基形 成的高度保守序列PCP（Pro-Cys-Pro）基序几乎 存在于所有的UP0,是航基（硫酸盐、Cys-SH）完美暴露于血红素叶琳环中铁离子的关 键。而在细胞色素P450单加氧酶中，例如Phe 和Leu等疏水氨基酸取代了 PCP基序44O在UP0 中，镁离子与来自血红素丙酸、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和丝氨酸（Ser）的三个叛基和一 个羟基配位，稳定了处于活性状态下的吓咻环体 系网。血红素上面含有一个基态的水分子，当催 化循环开始时，耳。?首先取代血红素上的基态水 分子形成中间体（Step a,血红素-Fe3+-H2O2,Compound 0）,再重排生成强氧化性关键中间体 氧-铁阳离子自由基络合物（Stepb,血红素-Fe4+二 0,Compound 1）,该中间体从底物中获取一个电 子和一个质子，生成质子化化合物氢氧化铁配合 物和底物自由基（R）（位于活性中心附近），它 们迅速重组形成羟基化产物（R-0H）-铁酶复合物（Step c,Compound 2）o然后，产物复合物随着羟 基化产物的释放而解离，水分子与血红素铁配位，再次开始催化循环（Stepd）（图1）叫血红素通道的结构与UPO的底物特异性、立体 选择性和区域选择性相关。不同UPO的通道尺寸、几何形状和氨基酸种类可能存在很大差异。2018 年，第一个由酿酒酵母表达的AoeUPO突变进化体 PADA-I的结构被解析w,分辨率为1.5 A。与野 生型相比，PADA-I突变进化体有着更宽的血红素 通道，展示出不同的底物特异性。Benjumea等,比较了 C5UPO与同样来源于子囊菌的毛壳菌科（chaetomiaceae family of ascomycetes）的 Cg/UPO 活性中心的氨基酸残基的区别及其催化脂肪酸区域 选择性的差异。分别将。2P0 88位与158位的苯 丙氨酸和苏氨酸突变为与Cg/UPO相同的亮氨酸（F88L突变体）和苯丙氨酸（T158F突变体），发现 F88L突变体显著拓宽了 CUP0的血红素通道，提 高了油酸与亚油酸环氧化产物：羟基化产物的比1240合成生物学第3卷NStep 6/dRH OCompound 2Compound 0Compound 1硫代血红素酶的氧化机理N、NAD(P)H Step 1Peroxygenase(Step ad)Step 5/c图1Cytochrome P450 monooxygenase(Step 16)Step 4/bStep 3细胞色素P450单加氧酶氧化过程包含6个步骤(Step 1-6),且需要NAD(P)H与O2的参与。UPO氧化机理以红色线条表示(Stepa-d),UPO不催化分子氧的还原活化，而是直接利用过氧化氢形成具有催化活性的氧-铁基阳离子自由基配合物，因此不依赖于昂贵的NAD(P)H 以及拥有更为简洁的电子传递链Fig.1 Mechanism of thioheme-catalyzed oxidationThe process of cytochrome P450 monooxygenase catalyzation consists of six steps and requires the participation of NAD(P)H and O2(Steps 1-6).The catalytic oxidation of UPO is indicated by red lines(Steps a-d).UPO do not catalyze the reduction and activation of molecular oxygen,but directly use hydrogen peroxide to form catalytically active ferric oxide groups,so it does not rely on the expensive NAD(P)H and has a more concise electron transport chain.例，突变后比例与Cg/UPO相近；而在158位引入 苯丙氨酸则是使通道变得更狭窄，限制了油酸的环 氧化。Cairo等使用计算机（adaptive-PELE软 件 阿）模拟脂肪酸进入AoeUPO、CciUPO和 MsUPO的过程以及与活性位点的相互作用，分析 这三个UPO催化脂肪酸区域选择性不同的原因，最 终聚焦于血红素通道的构象。作者以MwUPO I153F/S156F突变体实验验证了血红素通道影响 UPO区域选择性的假设，发现I153F/S156F突变体 引入两个苯丙氨酸，显著缩小了底物通道的尺寸，可以有效阻碍底物油酸以折叠的方式进入活性中 心，而是形成更多的末端氧化产物。5 UPO的底物谱upo可以催化的反应包括正构烷燃中未活化的cH键的羟基化、烯燃和芳燃的环氧化、含杂 原子（N、S）化合物的氧化、乙醛裂解、N-脱烷 基化、脱酰化和酚类的单电子氧化。目前已证明 UPO可氧化400多种化合物Wo5.1 烷煌和脂肪酸的氧化未活化CH键的氧化需要更高的活化能，是 目前有机合成中最具挑战性的反应之一。UPO氧化 直（支）链烷燃主要生成2-燃基化与3-羟基化产物（图2）,这与烷烧结构有关图3（a）（c）加；氧 化环烷燃主要生成羟基化产物，羟基化产物往往会 在UPO的作用下进一步过氧化生成酮，这与所用的 UPO种类相关。例如，MwUPO氧化环己烷生成的 羟基化产物与酮的比例接近1：1 图3（d）,而 AoeUPO氧化环己烷则主要生成羟基化产物，过氧 化反应并不明显由。UPO氧化脂肪族产物与底物 的链长相关，AoeUPO氧化C2。长链脂肪酸主要生第 3 卷 1241图2 UPO氧化烷燃反应通式Fig.2 The general formula for the oxidation of alkanes by UPO成1和32羟基化产物图3(e),羟化产物往 往会在UP0的作用下过氧化生成相应的醛和短 酸。与AoeUPO不同，MwUPO对脂肪酸a位碳 原子具有活性，将其氧化为a-璇基后发生脱酸反 应缩短脂肪酸(脱去1个碳原子)图3(f)2022 年，Olmedo 等 发现 AaeUPO、CczUPO 同 样可以催化脂肪酸碳链缩短(脱去2个碳原子)图3(g)。5.2 烯煌的氧化UPO氧化烯燃C=C双键通常会生成羟基化与 环氧化两种产物(图4),而这两种产物的比例与 烯燃的结构和UPO的种类有关跳。碳碳双键位于 C链中间时更倾向于生成环氧化产物，而烯丙位C 原子位于C链末端时基本只生成环氧化产物 图5(a)(c)。顺反异构体所引起的空间位阻差 异也会严重影响氧化效率，同一条件下，AaeUPO 氧化顺-2-丁烯和反-2-丁烯生成环氧化产物产率相 差2倍以上,图5(d)。5.3 芳煌的氧化UPO对芳香族的羟基化往往会存在一个环氧 化的中间体，而后部分重排生成羟基化产物(图6、图7).切。酚类产物会进一步在UPO的作 用下过氧化生成苯氧基自由基，而添加抗坏血酸 等还原剂可以有效地避免这一副反应的发生：56o5.4 含杂原子化合物的氧化UPO还能够将H2O2的氧转移到有机杂原子上，如硫原子、氮原子和滨原子(图8)。例如，芳燃 硫酸的硫原子被AaeUPO氧化，形成相应的亚碉和 碉(图9)卸。(b)(c)图3 UPO氧化不同烷煌与脂肪酸(a)(d)AaeUPO氧化直链(支链)烷烧、环烷煌；(e)AaeUPO羟化脂肪酸；(f)MroUPO氧化脂肪酸发生脱竣反应；(g)AaeUPO.CczUPO催化脂肪酸碳链缩短(脱去2个碳原子)Fig.3 Oxidation of alkanes and fatty acids by UPO(a)(d)AaeUPO oxidizes linear(branched)alkanes and cycloalkanes;(e)AaeUPO hydroxylates fatty acids;(f)MwUPO oxidizes fatty acids for decarboxylation;(g)AaeUPO/CciUPO catalyze fatty acid carbon chain shortening(removal of two carbon atom)1242合成生物学第3卷图4 UPO氧化烯燃反应通式Fig.4 The general formula for the oxidation of olefin by UPO图5 UPO氧化不同烯燃(a)(d)A%UPO氧化不同烯烧，烯煌结构的不同会影响羟化产物与环氧化产物的比例Fig.5 Oxidation of Olefins by UPO(a)(d)AaeUPO oxidizes different olefins,and the difference in olefin structure will affect the ratio of hydroxylation products to epoxidation productsFig.6 General formula for the oxidation of aromatic hydrocarbons by UPO图7 UPO氧化不同芳煌化合物(a)AaeUPO氧化苯ba；(b)AaeUPO氧化祭；AaeUPO氧化黄酮 Fig.7 Oxidation of aromatic hydrocarbons by UPO(a)AaeUPO oxidized benzene56;(b)AaeUPO oxidized naphthalene1551;(c)AaeXJPO oxidized flavonoids切9 人_ 9 Br-uPo Br_OH图8 UPO氧化含S、N或Br原子的化合物Fig.8 Oxidation of compounds containing S,N or Br by UPO图9 AaeUPO氧化芳煌硫酸同Fig.9 Oxidation of aryl alkyl sulfides by AaeUPO58第 3 卷 12435.5 裂解反应UP0催化的裂解反应包括酸和胺的C链断裂,首先生成不稳定半缩醛和半胺，分别脱去1个水分 子并形成醇、酚和醛以及伯（或仲）胺和醛由。四氢吹喃在AaeUPO作用下生成开环产物4-羟基丁 醇图10（a）.，5-硝基-1,3-苯并二氧戊环（NBD）在UPO作用下脱烷基化生成甲酸和4-硝基 邻苯二酚图10（b）。4-硝基邻苯二酚在酸性 条件下呈黄色，在425 nm处有特征吸收峰，可依 此构建测定UPO活性的高通量方法。AoeUPO在药 物西地那非的N-甲基哌嗪环处区域选择性地催化 N-脱烷基化图10（c）对初。这也可以看作是烷 基羟基化的特殊反应，因为反应初始阶段在相邻 的亚甲基（或甲基）上会发生羟基化反应 UPO通常会先攻击活化的CH键，所以脱烷基化 反应一般选择性较高，一般会脱去杂原子的a位碳 原子。5.6 UPO的选择性问题UPO底物谱广泛，但是野生型UPO通常面临 选择性差的问题。例如，CH或一CH?一基团的 羟基化经常伴随着过氧化。最初形成的（手性）醇会被进一步氧化成相应的酮、醛或竣酸 UPO的过氧化能力也被用于吠喃二段酸的合成（图11）回。在活化的CH键（茉基或烯丙基）的羟基化反应中经常产生环氧化产物UPO的 选择性同时还受底物空间位阻影响，AaeUPO催化 的苇基CH键羟基化具有高度的区域选择性和立 体选择性，然而，立体选择性随着底物侧链位阻 的增加而显著降低，空间位阻影响选择性还体 现在对烷燃、烯燃与脂肪酸0的反应中。此 外，芳烧羟基化产物苯酚往往会在UPO催化下产 生苯氧自由基，并自发聚合用。目前解决UPO选择性差问题的方法主要有更 换UPO种类和分子改造。底物羟基化的选择性在 不同UPO之间可能会有显著差异。例如，AaeUPO 催化维生素D选择性很差，但是CcfUPO催化维生 素D基本只生成25位碳原子的羟基化产物所。Lucas等认为是血红素通道与活性中心空腔的大小 不同影响了底物的摆动自由度，最终导致选择性 的不同。如前所述，血红素通道的结构、大小与 UPO的底物特异性、立体选择性和区域选择性相 关，目前针对UPO的选择性的分子改造也基本聚 焦于血红素通道，相关案例说明也列举于前述第4 部分。/0)ZaeUPO（a）AaeUPO催化四氢吠喃发生开环反应；（b）5-硝基-1,3-苯并二氧戊环（NBD）在UPO作用下脱烷基化生成甲酸和4-硝基邻苯二酚（c）AaeUPO选择性地催化药物西地那非的M甲基哌嗪环N-脱烷基化Fig.10 UPO catalyzes the cleavage reaction(a)AaeUPO catalyzed the ring-opening reaction of tetrahydro furan;(b)5-nitro-1,3-benzodioxole(NBD)was dealkylated under the action of UPO to form formic acid and 4-nitrocatechol;(c)AaeUPO selectively catalyzes the N-dealkylation of the A-methylpiperazine ring of the drug sildenafil图11 AaeUPO氧化5-羟甲基糠醛（HMF）生成吠喃二竣酸（FDCA）Fig.11 Oxidation of 5-hydroxymethylfurfural(HMF)by AaeUPO to 2,5-furandicarboxylic acid(FDCA)1244合成生物学第3卷6旦。2原位再生UPO不依赖辅因子提供还原力，而是直接利 用H2O2形成具有催化活性的氧-铁基阳离子自由基 配合物。但是UPO对H2O2极为敏感，适量的H2O2 可以提高UPO的催化效率，但是H2O2浓度过高会 形成过氧铁，破坏血红素活性中心。通过H2O2 传感器与耳。2补料系统结合自动补加耳。2似乎