第五篇：流式细胞仪结果分析.ppt

流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术(jsh)(jsh)及应用及应用第一页，共七十七页。第一节第一节 概述概述 一、工作原理一、工作原理 二、散射光的测定二、散射光的测定(cdng)(cdng)三、荧光测量三、荧光测量 四、细胞分选原理四、细胞分选原理第二节第二节 数据数据(shj)(shj)的显示与分析的显示与分析 一、参数一、参数 二、数据显示方式二、数据显示方式 三、设门分析技术三、设门分析技术第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒三、免疫胶乳颗粒(kl)(kl)的应用的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制第二页，共七十七页。第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴三、淋巴(ln b)(ln b)造血系统分化抗原及白血病免疫分型造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、五、AIDSAIDS病检测中的应用病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLAHLA抗原分析抗原分析 七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用思考题思考题小结小结(xioji)(xioji)第三页，共七十七页。流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞是以流式细胞仪为检测手段仪为检测手段(shudu(shudu n)n)的一项能快速、精确的对单的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。技术。第四页，共七十七页。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针过荧光探针(tn zhn)(tn zhn)的协助，从分子水平上获取多种的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏细胞不被破坏(phui)(phui)，测量快速、大量、准确、灵敏、定，测量快速、大量、准确、灵敏、定量量流式细胞术的特点流式细胞术的特点(tdin)第五页，共七十七页。流式细胞仪流式细胞仪是测量是测量(cling)(cling)染色细胞标记染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原等）进行快速、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。测量并可分类收集的高技术。第一节第一节 概述概述(i shi sh)第六页，共七十七页。第七页，共七十七页。细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测流式细胞仪常检测(jin c)的细胞特性的细胞特性第八页，共七十七页。采用激光作为激发采用激光作为激发(jf)(jf)光源，保证其具有更好的单色性与激发光源，保证其具有更好的单色性与激发(jf)(jf)效率；效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作一、工作(gngzu)原理原理 第九页，共七十七页。（1 1）液流系统液流系统(xtng)(xtng)（2 2）光学系统光学系统 （3 3）数据处理系统数据处理系统1.流式细胞仪的基本流式细胞仪的基本(jbn)结构：结构：第十页，共七十七页。由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的单荧光染料标记的单抗对其染色抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入流动从样品管进入流动室形成样本流室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于(chy)(chy)喷嘴中喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统）液流系统(xtng)第十一页，共七十七页。喷嘴喷嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液鞘液液流系统液流系统(xtng)示意图示意图第十二页，共七十七页。FCMFCM的液流系统的液流系统(xtng)(xtng)（如（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本样本(yngbn)(yngbn)管管鞘液管鞘液管第十三页，共七十七页。激光光源：气冷激光光源：气冷(q ln)(q ln)式氩离子激光器式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长长波长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统）光学系统第十四页，共七十七页。FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图第十五页，共七十七页。主要由计算机及其软件主要由计算机及其软件(run jin)(run jin)组组成成（3）数据处理系统）数据处理系统第十六页，共七十七页。基本工作基本工作(gngzu)原理原理第十七页，共七十七页。单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本基本(jbn)过程过程第十八页，共七十七页。区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别流式细胞仪与显微镜的区别(qbi)第十九页，共七十七页。细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线(gungxin)信号，它的强弱与细胞的大小、信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为分为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定(cdng)第二十页，共七十七页。第二十一页，共七十七页。前向散射光前向散射光（forward scatter,forward scatter,FSFS）：激光束照射细胞时，光以相激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度对轴较小角度(jiod)(jiod)(0.5(0.51010)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。第二十二页，共七十七页。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图第二十三页，共七十七页。侧向散射光（侧向散射光（side scatter,SSside scatter,SS）：）：激光束照射激光束照射(zhosh)(zhosh)细细胞时，光以胞时，光以9090角散射的讯号，用于检测细胞角散射的讯号，用于检测细胞内部结构内部结构属性。属性。第二十四页，共七十七页。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向侧向(c xin)散射光散射光示意图示意图第二十五页，共七十七页。测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行行(jnxng)(jnxng)分析或分选。分析或分选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞光散射测量最有效光散射测量最有效(yuxio)(yuxio)用途：用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 第二十六页，共七十七页。荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分号区分(qfn)(qfn)开，送入不同的光电倍增管。开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光三、荧光(ynggung)测量测量第二十七页，共七十七页。荧光染料荧光染料(rnlio)(rnlio)的特性的特性激发激发(jf)(jf)波长波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)第二十八页，共七十七页。第二十九页，共七十七页。荧光荧光(ynggung)补偿补偿第三十页，共七十七页。通过流式细胞仪进行细胞分选主通过流式细胞仪进行细胞分选主要要(zhyo)是在对具有某种特征的细胞需是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。四、细胞四、细胞(xbo)分选原理分选原理第三十一页，共七十七页。细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体(jngt)产生产生(chnshng)机机械振动械振动不充电不充电(chng din)充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理第三十二页，共七十七页。分选速度分选速度(sd)(sd)：单位时间内分选的细胞数量。与单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。百分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。速度成反比。（二）分选的技术（二）分选的技术(jsh)要求要求第三十三页，共七十七页。参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据数据(shj)(shj)显示方式显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假、假三维等高图三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据数据(sh(sh j j)的显示与分析的显示与分析第三十四页，共七十七页。FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量：反映颗粒被染上的荧光数量(shling)(shling)多多少少一、一、参数参数(cnsh)第三十五页，共七十七页。单参数单参数(cnsh)(cnsh)直方图直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析直分析(fnx)(fnx)方图方图设门分析设门分析(fnx)(fnx):REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式第三十六页，共七十七页。由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光(ynggung)(ynggung)与颗粒与颗粒计数计数(COUNT)构成，反映同样散射光或构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数（一）单参数(cnsh)直方图直方图第三十七页，共七十七页。单参数单参数(cnsh)直方图直方图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel(channel )第三十八页，共七十七页。双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定就可以确定(qudng)(qudng)细胞在图上的表达位置。细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（二）双参数（二）双参数(cnsh)直方图直方图第三十九页，共七十七页。1.双参数双参数(cnsh)直方图点图直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度第四十页，共七十七页。双参数双参数(cnsh)直方图点图直方图点图第四十一页，共七十七页。2.二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。曲线层次曲线层次(cngc)(cngc)越高越高(越里面的线越里面的线)所代表的所代表的细胞数愈多。细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。第四十二页，共七十七页。二维等高图二维等高图第四十三页，共七十七页。3.假三维等高图假三维等高图第四十四页，共七十七页。（三）三参数（三）三参数(cnsh)直方直方图图第四十五页，共七十七页。多参数多参数(cnsh)(cnsh)分析：当细胞标记了多色荧光，分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数（四）流式细胞仪的多参数(cnsh)分析分析第四十六页，共七十七页。Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞方图上，根据该图的细胞(xbo)(xbo)群分布群分布选定其中想要分析的特定细胞选定其中想要分析的特定细胞(xbo)(xbo)群，群，并要求该样本所有其他参数组合的直并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞方图只体现这群细胞(xbo)(xbo)的分布情况。的分布情况。根据门的形状又分为根据门的形状又分为(fn wi)(fn wi)了线性门、矩形门、了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析三、设门分析(fnx)技术技术第四十七页，共七十七页。A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞A A、B B、C C均为均为任意任意(rny)(rny)门门第四十八页，共七十七页。线性门线性门第四十九页，共七十七页。Region设置设置:区阈（区阈（region,R）与门）与门(gate,G)是两个是两个相关相关(xinggun)的概念，区阈可与门对应，但的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。是也可以包含于门。第五十页，共七十七页。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4-/CD3-D4 CD4-/CD3+如十字门分析如十字门分析(fnx)(fnx)时，时，起就可以由四个区域构起就可以由四个区域构成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。第五十一页，共七十七页。样本制备样本制备标记染色标记染色(rns)(rns)液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术流式细胞仪免疫分析的技术(j(j shsh)要求要求 第五十二页，共七十七页。外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞(xbo)(xbo)培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品一、免疫检测样品(yngpn)制备制备第五十三页，共七十七页。新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备(zhbi)(zhbi)机械法机械法酶处理法酶处理法化学试剂处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）第五十四页，共七十七页。适用条件适用条件:有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收发射发射(fsh)(fsh)光波长与激发光波长间有较大的波光波长与激发光波长间有较大的波长差长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光二、常用的荧光(ynggung)染料与标记染色染料与标记染色第五十五页，共七十七页。FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光(jgung(jgung)细细胞胞(x(xbobo)悬悬液液异硫氰酸荧光异硫氰酸荧光(ynggung)(ynggung)素素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料第五十六页，共七十七页。名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用常用(chn yn)的几类荧光染料的几类荧光染料第五十七页，共七十七页。用化学法将两种不同激发波长的染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在结合在一起，在488nm488nm激发光照射下，通过激发光照射下，通过一个一个(y)(y)荧光染料被激发后产生的发射波长荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。测到该特定荧光信号。能量能量(nngling)传递复合染料传递复合染料第五十八页，共七十七页。PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色(hngs)荧光花青花青(hu(hu qn)qn)苷苷5 5藻红蛋白藻红蛋白(dnbi)(dnbi)能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制第五十九页，共七十七页。荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式结构亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记荧光标记(bioj)(bioj)抗体特异性结合抗体特异性结合免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法直标直标:干扰少干扰少,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标:步骤多步骤多,干扰多干扰多,不需标记多种抗体不需标记多种抗体组合标记组合标记（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记(bioj)第六十页，共七十七页。免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小是把微小(wixio)(wixio)的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有检测速度极快，所以又有“液相芯片液相芯片”之称之称 。三、免疫胶乳三、免疫胶乳(jior)颗粒技术的应用颗粒技术的应用第六十一页，共七十七页。微小的乳胶微球分别染成上百微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置用探针在芯片上的坐标位置(wi zhi)给基因的特异性编码；而液给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）相芯片则是用颜色来编码）第六十二页，共七十七页。第六十三页，共七十七页。通过对标记不同荧光通过对标记不同荧光(ynggung)(ynggung)素分子的检测，素分子的检测，实现实现FCMFCM对可溶性物质的定量分析对可溶性物质的定量分析第六十四页，共七十七页。适当的制备方式适当的制备方式处理红细胞处理红细胞实体组织来源标本用机械实体组织来源标本用机械(jxi)(jxi)法法温度温度25253737，pH7.0pH7.07.27.2四、流式细胞免疫学技术的质量四、流式细胞免疫学技术的质量(zhling)(zhling)控制控制（一）单细胞悬液制备（一）单细胞悬液制备(zhbi)(zhbi)的质控的质控第六十五页，共七十七页。温度温度pHpH染料染料(rnlio)(rnlio)浓度浓度固定剂固定剂（二）免疫荧光染色（二）免疫荧光染色(rns)(rns)的质控的质控第六十六页，共七十七页。光路与流路校正光路与流路校正:确保激光确保激光(jgung)(jgung)光路与光路与样品流处于正交状态，减少变异（样品流处于正交状态，减少变异（CVCV）。）。PMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准:保证样品检测保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准绝对计数校准:保证计数的准确性。保证计数的准确性。Flow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-setFlow-setFlow-countFlow-count（三）仪器（三）仪器(yq)(yq)操作的质控操作的质控第六十七页，共七十七页。同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的选用相同源性的未标记单抗未标记单抗作为对照调整和作为对照调整和设置电压设置电压(diny)(diny)，以保证特异性。，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。结果达靶值，提示本次实验结果可靠。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控第六十八页，共七十七页。流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分仪对细胞表面的抗原成分(chng fn)(chng fn)进行标记分析，可进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。有效的手段和帮助。第四节第四节 在免疫学检验在免疫学检验(jiny(jiny n)n)中的应用中的应用第六十九页，共七十七页。T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫参与免疫调节、与自身免疫病的发生病的发生(fshng)有关有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析(fnx)(fnx)第七十页，共七十七页。细胞介导细胞毒性试验细胞介导细胞毒性试验(shyn)(shyn)(死细胞与活细胞死细胞与活细胞比例比例)细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统三、淋巴造血系统(xtng)及白血病免疫分型及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择用于选择(xunz)(xunz)化疗方案、判断预后及检出微化疗方案、判断预后及检出微小残留病变小残留病变第七十一页，共七十七页。CD4+Th细胞细胞(xbo)、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示对化疗表示对化疗(hu lio)(hu lio)药物耐药药物耐药四、肿瘤耐药基因四、肿瘤耐药基因(jyn)分析分析五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用第七十二页，共七十七页。HLA-B27可出现可出现(chxin)在在58%97%的的强直性脊椎炎强直性脊椎炎(As)患者患者六、自身六、自身(zshn)免疫病相关免疫病相关HLA抗原分析抗原分析第七十三页，共七十七页。FCM作为一个强大的技术平台，已应用作为一个强大的技术平台，已应用(yngyng)于多个于多个领域，其在移植免疫分析中的应用领域，其在移植免疫分析中的应用(yngyng)也越来越广也越来越广泛。目前移植免疫中的泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞应用主要包括流式细胞术的交叉配型（术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching,FCXM）和群体反应性抗体（）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody,PRA）检测。）检测。七、移植免疫七、移植免疫(miny)中的应用中的应用第七十四页，共七十七页。思考题思考题1.流式细胞仪的分析检测原理是什么？流式细胞仪的分析检测原理是什么？2.流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。3.何谓荧光补偿？何谓何谓荧光补偿？何谓“液相芯片液相芯片”技术？技术？4.细胞分选的基本原理。细胞分选的基本原理。5.FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？析的意义？6.如何进行如何进行FCM分析检测样品的制备？分析检测样品的制备？7.流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正(jiozhng)物？物？8.流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？9.流式细胞术有哪些临床应用价值？流式细胞术有哪些临床应用价值？10.流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？第七十五页，共七十七页。小小 结结流式细胞术（流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。定量分析或纯化分选。FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向(c xin)散射光反映散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。同抗原分子的表达情况。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。号保持其特异性。对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。第七十六页，共七十七页。内容(nirng)总结流式细胞仪分析技术及应用。细胞表面/胞浆/核-特异性抗原(kngyun)。透镜组：形成平行光，除去室内光。（三）三参数直方图。发射光波长与激发光波长间有较大的波长差。PE.PC.APC。光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。绝对计数校准:保证计数的准确性。Tc(CD3+CD4-CD8+T)。B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关第七十七页，共七十七页。