原理及操作.pptx

DSBKPCR原理及操作原理及操作DSBK主要内容主要内容一、一、PCR技术的基本原理技术的基本原理 二、二、PCR反应体系及反应条件反应体系及反应条件 三、三、PCR在在HLA-SBT中的策略中的策略四、检测流程及操作注意事项四、检测流程及操作注意事项五、实验结果分析五、实验结果分析DSBKPCR技技术术的的基基本本原原理理DSBK变性变性退火退火 延伸延伸DSBK二、二、PCR反应体系及反应条件反应体系及反应条件琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DSBK三、三、PCR在在HLA-SBT中的策略中的策略DSBKHLA Class I(A,B and C)SBT:HLA Class II(DRB1,DQB1)SBT:DSBK位点位点ABCDRDQAK BK CK DR1-1 DR1-3片段大小（bp）3k2.9k3k300左右3.5k 2k2k2k检测外显子24 242422323232313常规常规HLA配型位点信息配型位点信息DSBKPCR反应参数的设置A、B、CDRB1常常规DQB196oC 2min2min95oC 2min95oC 30sec30sec 93oC 15sec60oC 30sec30sec60oC 30sec72oC 3min30sec68oC 3.5min15oC ferverferver15oC ferverDSBK四、检测流程及操作注意事项四、检测流程及操作注意事项模板分装模板分装电泳泳MIX配制配制MIX分装分装上机上机DSBKMIX 配制配制MIX前先将所需的试剂准备好，使用前振荡并离心。将移液器、枪头等实验用品按要求摆放整齐 DSBKMIX的配制中酶最后加入。为防止漏加或重复加样，每加入一种试剂后，在该试剂用量数字后打勾做标记。DSBK模板分装根据PCR反应表所编的模板位置来编排相应的PCR板。加模板前将DNA振荡离心，按照对应的DNA条码号在离心管架上排列好存放模板的离心管的顺序，并复核一遍，以确保模板顺序与PCR反应表一致。样品应加到反应孔底部，并注意不同样品要换枪头。加完样品后检查是否加错或漏加DSBKMIX分装反应板上所标的位点选择相应的MIX；加MIX时移液器保持垂直，加同样的MIX时可不更换枪头；若枪头尖端有较多试剂悬挂，应让枪头贴壁后更换新枪头，防止接触到模板而造成污染;分装完成后，从孔板底部观察是否有漏孔，若有漏加应选用相应位点的MIX补加;胶垫方向与反应板一致，列数编号对应。DSBK电泳DSBK五、实验结果分析五、实验结果分析（1）不出现扩增条带 原因：原因：1、模板质量（含有抑制物，浓度纯度低）、模板质量（含有抑制物，浓度纯度低）2、引物质量（错配，引物降解）、引物质量（错配，引物降解）3、人为原因（体系错配，扩增程序有误）、人为原因（体系错配，扩增程序有误）对策：对策：1、纯化模板或重提或加大模板用量、纯化模板或重提或加大模板用量2、更换新引物、更换新引物3、重做、重做DSBK（2 2）出现非特异性扩增带）出现非特异性扩增带原因：原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶的质量差或量过高4、Mg2+浓度过高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：对策：1、重新设计引物2、降低模板或引物浓度3、减少酶量，更换另一种酶4、降低Mg2+浓度5、提高退火温度6、减少循环次数DSBK（3）出现片状拖带或涂抹带 原因：1、模板不纯2、buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP、Mg2+浓度6、减少循环次数DSBKPCR操作中出现的错误、原因及后果DSBKPCR操作中出现的错误、原因及后果DSBK 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而影响实验结果。实验前后都要做好清洁工作，如实验前桌面用清水酒精擦拭，实验后擦次氯酸钠，照紫外，通风，垃圾处理等。注意事项DSBK注意事项检查程序检查程序上机前要检查程序是否有更改。上样上样要保持在同一高度上，保证受热均一以避免边缘效应。热盖热盖应压紧以免硅胶垫不紧导致样品蒸干，但不可拧得过紧导致反应管变形。