LC_School_1_液相色谱基础知识B.pdf

Waters中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心液相色谱教程液相色谱教程(一一)液相色谱基础知识液相色谱基础知识 B2004 Waters CorporationHPLC分离原理公式与术语分离原理公式与术语?这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图?这张色谱图含有丰富的信息这张色谱图含有丰富的信息?现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论2004 Waters Corporation洗脱体积和峰宽洗脱体积和峰宽?这些是导出理论和定义所必需的基本测量这些是导出理论和定义所必需的基本测量V0=无保留化合物的洗脱体积无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积等于一个柱体积V1=化合物化合物1的洗脱体积的洗脱体积V2=化合物化合物2的洗脱体积的洗脱体积W2=化合物化合物2的峰宽的峰宽(以体积计以体积计)2004 Waters Corporation分离度分离度(R)的定义式的定义式?简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远2004 Waters CorporationR:分离程度的量度分离程度的量度?此处是几个计算分离度的实例此处是几个计算分离度的实例()2112WW21t tR+=()8.5.5211-5tR1-3=+=()2.5.5211-2tR1-2=+=t0t1t2t3时间时间.5 1 2 52004 Waters Corporation容量因子容量因子(K ):保留能力的量度保留能力的量度?k 是样品与填料作用强度的直接量度 是样品与填料作用强度的直接量度V0V1V2V3时间时间.5 1 2 5 3.5.5-2 k2=0V0V1V k1=:公式1.5.5-1 k1=9.5.5-5 k3=2004 Waters Corporation分离因子分离因子():峰分离程度的量度峰分离程度的量度?是两个化合物在同一套色谱系统上是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述保留差异的数值表述 0V1V0V2V 1k2k =或3.5-1.5-2 =12/的峰峰9 .5-1.5-5 =13/的峰峰V0V1V2V3时间时间.5 1 2 52004 Waters Corporation理论塔板数理论塔板数(N):分离效率的量度分离效率的量度?理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度的峰展宽的量度1600 N.5516 NWV16N22=100N2516NWV16N22=PW=.5PW=22004 Waters Corporation分离度方程式分离度方程式()+=1N141R分离因子柱效容量因子分离因子柱效容量因子?分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系?它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据2004 Waters Corporation分离度方程分离度方程:容量因子项容量因子项?若 若 =1,2,10 或或 20,R会如何变化会如何变化?()()=+=+1 N141R2004 Waters Corporation分离度与分离度与k的关系的关系k 值 值k 项 项k 分离度 分离度?0 0 01 1/2 .502 2/3 .673 3/4 .75 10 10/11 .9120 20/21 .95 k k 理想范围 理想范围?分离度分离度2004 Waters Corporation?若 若 =1.1 或或 1.4,R会如何变化会如何变化?分离度方程分离度方程:分离因子项分离因子项()()+=+=1N41R12004 Waters Corporation分离度与 的关系分离度与 的关系0.290.09=4.114.14.11.111.11.11?当值很小时当值很小时,其很小的改变也会引起较大的分离度变化其很小的改变也会引起较大的分离度变化,当值很大时此项接近当值很大时此项接近1.2004 Waters Corporation分离度方程分离度方程:柱效项柱效项?若若 N 增加增加 2倍 或倍 或 3倍倍,R会如何变化会如何变化?1 141N+=+=R2004 Waters Corporation分离度与分离度与 N 的关系的关系?分离度与理论塔板数的平方根成正比分离度与理论塔板数的平方根成正比()%N N结果塔板数变化结果塔板数变化 73%54.73000 3000N 41%44.72000 2000N 31.61000 1000N =73%122.415,000 15,000N 41%10010,000 10,000N 70.7 5,000 5,000N =2004 Waters Corporation影响峰宽的因素影响峰宽的因素?峰宽因其影响信噪比和分离度而显得很重要峰宽因其影响信噪比和分离度而显得很重要?为了研究塔板数和保留对峰宽的影响,我们把塔板数表达式为了研究塔板数和保留对峰宽的影响,我们把塔板数表达式改写为峰宽随保留和塔板数而改变的形式改写为峰宽随保留和塔板数而改变的形式=21r2rNV4W WV16N改写为改写为 2004 Waters Corporation峰宽与保留体积的关系峰宽与保留体积的关系?这张峰宽对保留的曲线图清楚地显示其线性关系这张峰宽对保留的曲线图清楚地显示其线性关系1000 2000 3000 4000 5000保留体积保留体积(l)50100150200250300N=5000N=5000峰宽峰宽(l)2004 Waters Corporation峰宽与塔板数的关系峰宽与塔板数的关系?峰宽与柱死体积以及峰宽与柱死体积以及k的关系的关系可用另一个式子表达可用另一个式子表达()()2100r21rN k1V4 Wk1VV,NV4W +=+=得代入则由若,2004 Waters Corporation峰宽与塔板数的关系峰宽与塔板数的关系2000400060008000050100150200250300k =2,Vo=1000 L峰宽峰宽(L)塔板数塔板数2004 Waters Corporation不对称因子不对称因子(As)ABAs=4.4%峰高峰高AB?不对称因子常用于测定峰拖尾不对称因子常用于测定峰拖尾?不对称因子可用多种方法测定此处所示是典型的一种不对称因子可用多种方法测定此处所示是典型的一种2004 Waters Corporation峰拖尾对分离度的影响峰拖尾对分离度的影响11.21.41.61.82012345?若不对称因子由1变为1.4,则柱效,N,必须增加1倍才能保持分离度不变若不对称因子由1变为1.4,则柱效,N,必须增加1倍才能保持分离度不变0NN10%的不对称的不对称2004 Waters Corporation等板高度等板高度(HETP)的定义的定义HETP=柱长柱长/塔板数塔板数=L/N(HETP=Height Equivalent to a Theoretical Plate)2004 Waters Corporation范第姆特范第姆特(Van Deemter)方程方程?范第姆特范第姆特(Van Deemter)方程能够推导出流动方程能够推导出流动相的线速度对给定峰的等板高度相的线速度对给定峰的等板高度(H)的影响的影响.线速度=+=线速度=+=CBAH其中其中:A项项:叫作涡流扩散项叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关B项项:叫作轴向叫作轴向(纵向纵向)扩散项扩散项,与流速有关与流速有关C项项:叫作传质阻力项叫作传质阻力项,与填料颗粒度和流速有关与填料颗粒度和流速有关2004 Waters Corporation范第姆特范第姆特(Van Deemter)方程方程?范第姆特范第姆特(Van Deemter)方程的方程的另一种表达形式：另一种表达形式：2004 Waters CorporationVan Deemter 曲线曲线?这条曲线表明随着流速的改变这条曲线表明随着流速的改变A,B,C三项对三项对H的影响的影响?最上面的虚线是其综合效应最上面的虚线是其综合效应12CAB线速度线速度()HETP03692004 Waters Corporation塔板数与塔板数与 H 和和 L的关系的关系?现在我们重新定义现在我们重新定义 HETP变为理论塔板数的方程式变为理论塔板数的方程式以便研究影响理论塔板数的因素以便研究影响理论塔板数的因素LNH=因为=因为LHN=所以=所以2004 Waters Corporation塔板数关系式塔板数关系式(Knox方程方程)的推导的推导?我们使用基于我们使用基于Giddings的折合参数修正的的折合参数修正的Van Deemter方程方程?这些修正给出用填料颗粒度和流动相的折合速度描述的塔板数这些修正给出用填料颗粒度和流动相的折合速度描述的塔板数()()v.05v2vdLNhdLN.05vvvh,Ddv,dHhHETP,31pp31mpp+=+=则由于范第姆特方程的吉丁斯修正折合线速度折合则由于范第姆特方程的吉丁斯修正折合线速度折合2+?由此式可知由此式可知:填料颗粒度填料颗粒度dp越小越小,N 越大；越大；流动相流速流动相流速V 越高越高,N 越大越大2004 Waters Corporation影响塔板数的因素影响塔板数的因素?用折合速度代入,我们得到塔板数与柱长,溶剂速度,用折合速度代入,我们得到塔板数与柱长,溶剂速度,填料颗粒度以及在流动相中的扩散速度的关系式填料颗粒度以及在流动相中的扩散速度的关系式 .05 mpm31mppmpDd2DDddLNDdv 2+=折合速度其中=折合速度其中:Dm:扩散系数扩散系数,dp:填料颗粒度，填料颗粒度，L：柱长，：柱长，:溶剂线速度溶剂线速度,V:折合速度折合速度2004 Waters Corporation塔板数与流速的关系塔板数与流速的关系塔板数塔板数x 310123456789101112131415051015?塔板数对线流速的曲线图塔板数对线流速的曲线图流速流速(cm/min)2004 Waters Corporation线速度与流速的换算线速度与流速的换算0.70.150.0411.40.30.0722.80.60.1344.20.90.2065.51.20.2887.01.50.3410流速4.6 mm ID流速流速2.1mm ID(mL/min)流速流速1.0mm IDmL/min线速度线速度mm/secu(mm/s)2.1 x 20 mm,1.7 m2.1 x 20 mm,2.5 m2.1 x 20 mm,5 m024681012140.0002.0004.0006.0008.00010.00012.000HETP(m)UPLC RangeLC/MS“Narrow-bore”