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第三章 药品质量标准分析方法的验证

药品质量标准的分析方法必须经过评价（evaluation），或验证（validation）。
《中国药典》（2010 年版） 收载了“药品质量标准分析方法验证指导原则”（附录 ⅩⅨ A）
验证的目的：
证明采用的方法适合于相应的检测要求。
验证的范围：
建立药品质量标准时，药物生产工艺变更，制剂处方变更时，对原分析方法进行修订时，均需对有关的检验方法进行验证。
需验证的分析项目：鉴别试验，杂质检查（限量检查、定量检查），含量测定，制剂溶出度、释放度检查中溶出量的测定方法等。
验证的内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

一. 准确度（accuracy）
定义：准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率（%）表示。
1. 含量测定方法的准确度
（1）原料药
a. 用已知纯度的对照品或样品进行测定；（计算回收率，或用t检验判断）
b. 用本法测定的结果与已知准确度的另一方法的测定结果进行比较。 （用t检验判断）
（2）制剂
a. 回收试验：在空白辅料中加入已知量的测定组分的对照品，混匀，作为模拟样品，用待考查的方法测定，计算回收率。
b．加样回收试验：如不能得到制剂的全部组分，可在已知含量的样品中加入一定量测定组分的对照品，用待考查的方法测定，计算回收率。
c. 用本法的结果与已知准确度方法测定的结果进行比较。（用t检验判断）
（3）如该分析方法已经测试并求出了精密度、线性和专属性，在准确度也可以推算出来的情况下，这一项可不必再作。
2. 杂质的定量测定
a. 回收试验：向原料药或制剂加入已知量的杂质进行测定。
b. 如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。
c. 可以使用主成分作为对照进行测定。
3. 数据要求
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。如用高、中、底三个浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定。
应报告回收率，测定值与真实值之差或可信限。
4. 讨论
（1）回收试验的测定方法应与验证的方法一致，应包括验证方法的所有步骤。应报告样品含量（加样回收试验）、加入量、测得量、回收率、平均回收率和RSD。（测定范围见 〝范围″项下）
（2）制剂：化学药品制剂一般作回收试验，中药制剂作加样回收试验。加样回收试验中对照品的加入量和供试品中被测成分的含有量之和应在标准曲线范围内，一般中间浓度的加入量和供试品中被测成分的含有量之比控制在1∶1。
（3）ICH原料药准确度、精密度和线性的验证方法
编 号
第 一 组
第 二 组
第 三 组
X1j
Y1j
X2j
Y2j
X3j
Y3j
1
60%
X11
Y11
X21
Y21
X31
Y31
2
80%
X12
Y12
X22
Y22
X32
Y32
3
100%
X13
Y13
X23
Y23
X33
Y33
4
120%
X14
Y14
X24
Y24
X34
Y34
5
140%
X15
Y15
X25
Y25
X35
Y35

用此组数据计算精密度，线性和回收率。
计算每天的线性和总的线性；
计算回收率和平均回收率；
回收率＝ ×100%

按回收率计算日内精密度和日间精密度。
二．精密度（precision）
1. 定义：是指在规定的测定条件下，同一均匀的供试品，经多次取样测定所得到结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差和相对标准偏差来表示。
(1) 相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）
标准偏差为一统计学参数，表示随机变量的离散程度。
标准偏差（S）＝

相对标准偏差 (RSD) ＝
（2）相对平均偏差
平均偏差（ ）＝

相对平均偏差=
相对平均偏差无统计学意义，目前多用RSD表示精密度。
2. 测定方法
（1）重复性（repeatability）：在相同的条件下，由同一个分析人员测定所得结果之间的接近程度称为重复性。
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。如设计3个不同的浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液，进行测定；或取相当于100%的浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价，计算平均值和RSD。
（2）中间精密度（Intermediate Precision）： 在同一个实验室，不同的时间，由不同的分析人员，用不同的设备测定结果的精密度，是考察一个实验室内变动因素对精密度的影响。
日内（批内）精密度（within day(run) precision）： 同一天内, 使用同一批试剂，由同一人操作的精密度。一般每2小时测定一次，至少5个数据，计算平均值和RSD。
日间（批间）精密度（between day(run) precision） ： 不同天，由不同的人，使用不同批次试剂测定结果的精密度。至少4个数据，计算平均值和RSD。
（3）重现性（reproducibility, ruggedness）
在不同的实验室，由不同的分析人员测定结果的精密度。即在各种不同的正常实验条件下测定的精密度。
如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性的结果。
数据要求：
应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。
三．专属性（specificity）
定义：专属性是指在其他成分（如杂质，降解产物，辅料）可能存在的情况下，分析方法能准确地测定出被测组分的能力。
１. 鉴别反应：
应能与共存物质或结构相似的化合物区别。
可作阴性对照试验加以证明。
2. 含量测定和杂质检查
色谱法和其他分离方法：给出代表性的图谱，说明其它成分无干扰；色谱法中的分离度应符合要求。
在杂质可以得到的情况下，对于含量测定，于样品中加入已知的杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料样品的结果比较。对于杂质的测定，可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质之间是否能得到分离。
在杂质不能获得的情况下，可对含有杂质或降解产物的样品进行测定，与另一个经验证方法的结果进行比较；
作强力破坏试验：用强光照射，高温，高湿，酸水解，碱水解，氧化反应等等方法进行加速破坏，以考察降解产物有无干扰；

作色谱峰的纯度检查：光二极管阵列检测器或质谱检测。
四.检测限（Detection Limit , DL）
定义：检测限是指样品中被测组分能被检出的最底量或浓度。鉴别试验和杂质检查方法均应对检测限进行考察。
1. 非仪器分析的目视法
取不同量（浓度）的样品进行试验，用目视法确定可被检出的最低量（浓度）。
2. 信噪比法
用于能显示基线噪音的分析方法。将已知低浓度试样的信号和空白样品的信号进行比较，按信噪比为3∶1或2∶1确定。

色谱信噪比计算示意图(S/N=2H/h)
3. 空白信号标准差法

式中,σ为空白信号的标准差，S为标准曲线的斜率。
σ的测定：
空白溶液测定值的标准差；包含DL的标准曲线线性回归的残差或截距的标准差。
五．定量限(Quantitation Limit , QL)
定义：定量限是指样品中被测组分能被定量测定的最低量（浓度）。其测定结果应具一定准确度和精密度。
杂质和降解产物用定量方法测定时，应确定方法的定量限。
1. 信噪比法
用于能显示基线噪音的分析方法。按信噪比为10∶1 确定定量限。
2. 空白信号标准差法

σ：空白信号的标准差，S:标准曲线的斜率
六. 线性（linearity）
定义：是指在设计的范围内，测试结果与被测组分浓度成线性关系的能力。
测定方法：在测定的范围内配制系列浓度的对照品溶液，至少5份，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图（标准曲线）；再用最小二乘法以响应值对浓度进行线性回归。必要时响应信号可经数学转换，再进行线性回归。
要求给出回归方程和相关系数。
七．范围 (range)
定义：指能达到一定精密度，准确度和线性，测定方法适用的高低限浓度（量）的区间。
原料药和制剂的含量测定：80 % ~120%，
制剂含量均匀度：70% ~130%，
溶出度和释放度：限度的±20%，
杂质的测定：限度的±20%，如含量测定和杂质检查同时进行，用归一化法测定，线性范围应为规定杂质限量的-20%至含量限度的+20%。
八．耐用性（robustness）
定义：是指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的能力。
典型的变动因素：样品溶液的稳定性，样品提取的次数、时间；
液相色谱法的典型变动因素有：流动相组成、pH值，不同厂牌、批号的色谱柱，柱温，流速等；
气相色谱法的典型变动因素有：不同厂牌、批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器的温度等。
九、系统适用性试验
见《中国药典》有关规定。

检测项目和验证的内容：见资料。

参考文献
1. 《中国药典》附录：药品质量标准分析方法的验证
2. ICH Q2: Validation of Analytical Procedure

内容总结

（1）第三章 药品质量标准分析方法的验证

药品质量标准的分析方法必须经过评价（evaluation），或验证（validation）
（2）应报告样品含量（加样回收试验）、加入量、测得量、回收率、平均回收率和RSD
（3）（测定范围见 〝范围″项下）
（2）制剂：化学药品制剂一般作回收试验，中药制剂作加样回收试验

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