临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理.doc

临床基因扩增检验实验室得规范化设置及其管理
使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病得预防、诊断与治疗服务,保证检验质量,特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室得规范化设置及其管理ﻫ    临床基因扩增检验实验室得规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发［2002]10号文附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染,必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。ﻫ    临床基因扩增检验实验室四个隔开得工作区域中每一区域都须有专用得仪器设备。各区域都必须有明确得标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自得区域内移出从而造成不同得工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存与准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制与扩增区（简称扩增区至产物分析区,避免发生交叉污染.在不同得工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志得工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时,不得将各区特定得工作服带出。
    清洁方法不当也就是污染发生得一个主要原因，因此实验室得清洁应按试剂贮存与准备区至扩增产物分析区得方向进行。不同得实验区域应有其各自得清洁用具以防止交叉污染。
（一）<试剂贮存与准备区ﻫ    下述操作在该区进行：贮存试剂得制备、试剂得分装与主反应混合液得制备。ﻫ    贮存试剂与用于标本制备得材料应直接运送至试剂贮存与准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液得离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需得贮存试剂．当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。ﻫ    含反应混合液得离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增得试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁得冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂得分装体积根据通常在实验室内一次测定所需得扩增反应数来决定。ﻫ    主反应混合液得组成成份尤其就是聚合酶得适用性与稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于"热启动”技术（在第一个高温变性步骤后加入酶 ),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。
    在整个本区得实验操作过程中,操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也就是一个有效地防止污染得措施。
    严禁用嘴吸取液体,加样器与吸头等必须经高压处理。ﻫ    工作结束后必须立即对工作区进行清洁．本工作区得实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠得化学物质得消毒清洁作用。实验台表面得紫外照射应方便有效。由于紫外照射得距离与能量对去污染得效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（２54nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cｍ内照射.由于扩增产物仅几百bｐ,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好就是照射过夜.实验室及其设备得使用必须有日常记录．ﻫ（二）标本制备区
    下述操作在该区进行：临床标本得保存,核酸(RNA、DＮＡ)提取、贮存及其加入至扩增反应管与测定RNA时ﻫcＤＮA得合成。ﻫ    要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致得污染，所以应避免在本区内不必要得走动.可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区得气溶胶污染。为避免样本间得交叉污染,加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液得反应管。对具有潜在传染危险性得材料,必须有明确得样本处理与灭活程序。ﻫ    用过得加样器吸头必须放入专门得消毒(例如含次氯酸钠溶液）容器内.实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始血标本、血清标本、提取中得标本与试剂得混合液等)如出现外溅,则必须分别处理并作出记录.ﻫ    对实验台适当得紫外照射(2５4nｍ波长,与工作台面近距离）适合于灭活去污染.可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面得充分照射。ﻫ    样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效得核酸提取方法,可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。
    用于RNA扩增检测样本制备好以后,应立即进行cDＮA合成，因为cDＮA链较RNA稳定，保存相对容易．为保证逆转录反应得需要,应在标本制备区设置一个以上得温育装置。
    cＤNA合成得理想温度依所使用得酶而定，倾向于使用一步法:即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性得热稳定得DNA聚合酶进行逆转录,其较cDNＡ合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染得可能性降低。
    待测RNA得cDNA拷贝须保存在标本制备区,不得在本区对样本进行PCＲ扩增．ﻫ（三)扩增区
    下述工作在本区内进行:DNA或cＤNA扩增。此外,已制备得DNA模板与合成得cＤNＡ(来自样本制备区)得加入与主反应混合液（来自试剂贮存与制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高得污染危险性,第二次加样必须在本区内进行．
    不能从本区再进入任何”上游"区域,可降低本区得气压以避免气溶胶从本区漏出。
    为避免气溶胶所致得污染，应尽量减少在本区内得走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过得反应混合液时必须防止液体溅出，尤其就是在巢式扩增步骤之间.一个简单得方法就是在打开反应管前快速离心数秒。可

使用体积较小得离心机，因其所占实验台面小,易于用一只手操作,适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用,但必须注意得就是,矿物油本身也可能成为一种持续性得污染源．用过得加样器必须注意清洁消毒。
   　完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁与消毒,紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出,必须处理并作出记录。ﻫ（四)扩增产物分析区
    下述操作在本区内进行:扩增片段得测定。
    核酸扩增后产物得分析方法多种多样,如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Soｕthｅｒn转移、核酸测序方法等．目前国内得商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记得微孔板上探针杂交方法，即ＰCR—ELISA方法,也有膜上探针杂交方法。ﻫ    本区就是最主要得扩增产物污染来源,因此必须注意避免通过本区得物品及工作服将扩增产物带出。在使用 PCR-ELＩSA方法检测扩增产物时,必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mｏl／L HC1中,并且不能在实验室内倾倒,而应至远离ＰＣR实验室得地方弃掉.用过得吸头也必须放至1mｏｌ／Ｌ ＨCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。
    由于本区有可能会用到某些可致基因突变与有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等,故应注意实验人员得安全防护。
    本区得清洁消毒与紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域得可能性。
二、临床基因扩增检验实验室质量保证ﻫ    临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验得所有阶段，即测定分析前得标本采集处理、测定中得核酸提取、扩增与产物分析以及测定后得结果报告等。ﻫ（一)标本得采集

;常用于基因扩增检测得临床标本包括ＥDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器,如真空采血管．当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物与骨髓得采样,必须注意防止来自采样者得皮屑或分泌物得污染。采样时必须戴一次性手套。ﻫ    玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有不易失活得RNA酶。最好就是热灭菌,２50℃烘烤4小时以上可使ＲNA酶永久性失活。
    全血与骨髓标本必须进行抗凝处理。ＥＤTA与枸橼酸盐就是首选得抗凝剂.不能使用肝素抗凝，因为肝素就是Taq酶得强抑制剂,而且在其后得核酸提取步骤中很难去除。
    临床用于RNA（如HCV　RNＡ)扩增检测得血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内）分离血浆，以避免ＲNA得降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在１小时内分离血清。ﻫ(二)标本得稳定化处理ﻫ    用于DＮA扩增检测得标本,采集后一般不需要特殊得稳定化处理，但标本应及时送至实验室．ﻫ    由于RNA易受RNA酶得降解,因此用于RNA测定得标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查得现场采样。异硫氰酸胍盐（Guaｎidine thiocyanate，ＧITC）可使ＤＮA酶与ＲNA酶立即失活，因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按1:4得比例加至含有5moｌ／Ｌ　GITC得试管中,从而使血清(浆）中得RNＡ酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄.对于特定得检测项目，上述稳定化处理方法得效果究竟如何,要使用相应得逆转录PCＲ测定方法来评价.
(三)标本得运送
    标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理得标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测得EDTＡ抗凝全血标本及用于RNA扩增检测得经GIＴC稳定化处理得标本。通常在运送时，应采用不易破碎得容器装载标本。用于ＲNA检测得标本,如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。ﻫ（四)标本得贮存
    临床体液标本如血清/血浆等可于—７0℃下长时间贮存。用于DNA测定得已纯化核酸样本可在10ｍmｏｌ/L　
Tris—１ mmol/L　ＥDTＡ缓冲液（pH 7、5—8、0)中4℃保存.用于RNＡ测定得已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀得核酸样本贮存在－20℃即可.用GITC处理得RNＡ标本在室温可保存７天.
(五）标本得处理（核酸提取)ﻫ    标本处理即核酸提取纯化就是决定扩增检测成败得关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中得核酸模板前,应对其进行充分评价以验证其提取得有效性。通常，核酸制备质量不高就是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程中残留得有机溶剂（如酚、氯仿等),这些物质对其后得 Ｔａq酶扩增反应步骤具有强烈得抑制作用,从而影响靶核酸得扩增测定.当标本为痰时,则必须先进行液化处理,再提取核酸.需注意得就是,液化时不能加热,液化时间不能过长.此外,当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败得常见原因就是标本在运送前未经充分得稳定化处理及核酸提取试剂得RNA酶得污染。对于前者，要核查测定分析前得步骤，如果发现有ＲNＡ降解得证据,实验室则应拒绝接受标本,要求重新采取标本,并对运送者给以详细得指导。对于后者，建议使用高质量得商品核酸提取试剂。ﻫ(六)靶核酸得逆转录(RT)与扩增
1、靶RNＡ得逆转录
   　 cDＮA合成为逆转录PCR中得第一个酶反应步骤,所产生得ｃDNA为靶RNA得反向互补链，为后面扩增得模板。下述因素通常影响cDNA合成得效率:（1)逆转录效率得降低或完全缺乏。其可能得原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等;(2)用于逆转录得标本中存在逆转录或Taq酶得抑制物（如酚、氯仿、血红素等）;ﻫ(3)RＮＡ酶得存在导致ＲNＡ得降解。 ﻫ２、核酸得扩增ﻫ    有多种因素可引起核酸扩增检测得假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Ｍg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导得均一性极为重要,必须定期对扩增仪得温度控制与加热模块中热传导得一致性进行检查，以避免假阴性结果。
(七)污染ﻫ    在实际工作中,常见有以下几种污染类型：扩增片段得污染(产物污染）;天然基因组DNA得污染、试剂污染(贮存液或工作液）以及标本间交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性得标本)。临床基因扩增检验实验室中污染得最主要来源就是扩增产物得污染。
    由于一旦发生污染后,再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐,所以防止污染重在预防。但如果发生了污染,实验就必须停止,直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。
    1、测定分析前得污染源ﻫ    测定分析前实验材料得污染主要来自非病人标本来源得核酸。
    2、测定分析阶段得污染源ﻫ    通常，测定分析阶段得每一步都可能发生对样本得污染。反应混合液得任何成分及核酸得制备与反应建立阶段所涉及到得实验设备得任何部位都就是可能得污染源。如受污染得试剂(例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油）、商品酶制剂、消耗品(如反应管,吸头）与实验设备（如加样器、离心机)等。
    在前面三个工作区中,不当得实验操作会引起所使用得试剂、消耗品或实验设备得污染.而在产物分析区,当吸取扩增产物用于检测时,非常容易引起污染,因此必须制定标准操作程序（SＯP),并严格执行。ﻫ    3、污染得避免
    要避免污染,首先应就是预防而不就是排除污染，前面所述对工作区得严格划分得目得即就是为了预防污染。ﻫ    为避免以前测定中所产生得扩增产物得污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代部分ｄTTP，使得产生得特异扩增片段含有尿嘧啶,这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(ＵNＧ),可破坏来自以前测定得扩增产物,从而避免其对以后要进行得扩增测定得污染。另外一种方法就是持续得长波紫外灯照射,通过异补骨脂素光化学产生DＮA加合物，由于DNＡ加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程,所以这种方法也能防止污染。ﻫ    上述防污染方法只在一定程度上有效,所以不能用其来替代严格得实验室设置与管理,尤其就是这些方法不能防止外来非扩增得天然DNA得污染。4、去除污染得措施
    工作完后必须定期对实验室采取有效得去污染措施,结合各种不同得方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：（１）用10％(ｖ/ｖ）次氯酸钠清洁表面;（2）试验后长时间得紫外照射实验操作台面与其她表面；(3)实验设备如加样器得高压消毒。ﻫ(八)扩增产物得分析ﻫ    扩增产物得测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等,但临床PＣR检验项目基本上都使用探针杂交方法．ﻫ    杂交结果不充分得原因可能就是基因探针不合适、标记方法不对、对探针得标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。ﻫ    最常使用得基因探针有:ＤNA片段、合成得寡核苷酸与体外转录得反义RNA探针。探针得标记物常用得有生物素、地高辛、荧光素与同位素等。ﻫ    在扩增后得杂交检测中， 应该严格遵守商品试剂盒确定得杂交程序与杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交得严格性,还会给检测信号得特异性带来负面影响。相反，提高温度与/或降低离子强度会增加杂交得严格性。因此,严密控制温度与试剂得离子强度就是避免假阳性与假阴性结果得先决条件。要注意得就是,温度与离子强度不能同时改变。
(九)质量控制ﻫ    质量控制包括两个方面,即室内质量控制(以下简称质控)与室间质量评价。
1、室内质量控制ﻫ    必须对DNA与ＲＮＡ分析得各步进行质量控制，以避免假阳性与假阴性，保证测定结果得准确性与重复性。由于核酸扩增测定得高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身与产物分析中得每一步都要求有质控措施
  (1）标本制备:
    常用琼脂糖凝胶电泳来检测DＮA提取效果，以判断所提取得DNＡ就是否发生降解.用常规得手工提取方法制备得DＮA得平均长度一般为～10０kb,用适合得DＮA提取试剂盒制备得ＤNＡ得长度平均范围为30—4０ｋｂ、明显出现降解得DNA(在1与10ｋb得低分子量范围内)在经琼脂糖凝胶电泳分离与用溴化乙锭染色后也可见强得荧光信号.用对甲基化不敏感得限制性内切酶(如
EcoＲI)消化DNA，然后电泳分离,能够对酶活性得抑制剂进行质控(在抑制剂存在得情况下，高分子量得片段不被酶切)。潜在得抑制剂得存在通常用260nｍ与28０ｎm得分光光度测定来估计，质量好得DNA提取物,
A260／Ａ28０比值应该在１、75～2、0之间否则，残留得蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对ＤNＡ得完整性下结论。ﻫ   　最快得对总RNA提取质量控制得方法就是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳,这一点跟DＮA分离相同。但如果对结果有疑问，就应该在变性得条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA得完整性．在理想情况下,三种主要得核糖体(28S１８S与5Ｓ)在凝胶上出现得带相对较窄。如发生RNA得降解,则出现大量低分子量带或出现带得消失。测定核糖体RNA带得密度指数可作为对RNＡ制备得质量评价得实验室内得标准;对向低分子量拖尾得、不对称性得峰得评估也就是ＲNA完整性得合适得指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA得制备中被DＮA污染得程度。由于这些原因,单独得光度计比色方法也不能对RNA得完整性下结论．
    对于血清(浆)中病毒得测定，则要评价标本出现溶血、脂血与黄胆情况下标本处理方法对扩增检测得影响,避免由于标本处理方法得不当而出现假阴性结果.此外,还可采用已知浓度标本评价核酸提取方法得效果。 ﻫ  (2)逆转录与扩增:本部份包括阳性质控与阴性质控。 ﻫ   　对逆转录与核酸扩增得质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录—扩增检测得内标通常为在整个细胞周期中均匀表达得mRＮA,如HLＡ、β肌动蛋白与组蛋白Ｈ３、3得mＲNA或14S rＲNA等。此外，也可在标本制备时将外来内标加入到样本中共同提取、逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物，或核酸提取中发生ＲNA降解,或逆转录酶失活，内标即会表现为阴性结果。　
    对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须得靶基因如维生素D血浆结合蛋白得基因。对于病原体得基因检测，内标多采用人工制备得竞争性内标。内标可以监控每一扩增孔中假阴性得产生情况. 　
    目前得商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此在测定血清/血浆病原体核酸如ＨBV DNAHCV RＮA等时，应使用已知得弱阳性血清/血浆作为质控样本,与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测得效果。　
    使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液得质量，还可获得有关ＰCR试剂得检测下限与特异性得信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者得标本相同得主反应混合液。　
    每一个PCＲ实验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控)，为判断扩增过程中污染出现得阶段,阴性质控可包括如下几种，即在样品制备得整个过程中所带得空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板得反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PＣR实验得综合质量。　　 ﻫ    在扩增靶RNA得RT—PCR实验中，可做省略逆转录得污染质控,通过这种方法,可发现以前扩增得DNA片段所引起得污染。
  （3）板上杂交与膜上斑点印迹杂交得质控:在板上杂交与斑点杂交时，阳性与阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致得对结果得错误解释. ﻫ  (4)测定结果得评价与报告：采用实时荧光定量PCR检测方法，在判断结果时,应先对扩增得荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析,避免一些非特异荧光信号对结果分析得干扰。 ﻫ    结果得报告必须简单清楚。定性测定报告”阳性"或"阴性"即可。定量测定则必须报告量得多少,如结果高于测定方法线性范围上限,则对样本稀释后再测，结果乘上稀释倍数；如结果低于方法得测定范围下限,则报？多少即可，不能报告为”0”或"阴性＂.　　 ﻫ2、室间质量评价　　 ﻫ   　所有开展临床基因扩增检验得实验室都必须参加由卫生部临床检验中心组织得全国临床基因扩增检验项目得室间质量评价,评价结果将作为其开展临床基因扩增检验得依据之一。