临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立.doc

<p>临床PCＲ实验室得设计及质量管理体系得建立
　 &nbsp; 　　　卫生部临床检验中心　　
核酸（DＮA与ＲNA）就是生命现象得基础。小到病毒、细菌等微生物,大到动植物与人类，都无一例外.因为主导生命活动得受体、细胞因子、酶、激素等均不过就是核酸发挥功能作用得表型,均由核酸决定，在核苷酸序列上哪怕就是单个碱基得变异，都会引起表型得完全改变,并进而影响生命功能得发挥，导致疾病得发生。因此,在核酸或称为基因水平上检测,对临床疾病本质得揭示就要更深一步。也正因为核酸就是生物体生命活动之源,对于感染性病原体得检测,从核酸着手,最能反映病原体在机体内得出现与消长．
自从美国Ceｔｕs公司Mullis博士在19８3年发明聚合酶链反应（PＣR)这种核酸扩增技术以来，由于其极高得检测灵敏度与特异性，因而在临床感染性疾病、遗传病、肿瘤等得诊断与疗效观察上得到了广泛得应用,在器官移植得基因配型上也就是难以替代得技术。其应用大大提高了上述疾病诊断得准确性与快速性.但临床PＣR检验必须按规范要求进行,并有严格得实验室质量管理,否则,因其极高得检测灵敏度,实验室稍有以前扩增产物得污染，或在标本核酸提取过程中标本间得交叉污染,均可导致假阳性结果得出现。同时，也会因为试剂与实验消耗品得质量不过关、仪器设备得维护校准不到位，或操作得不规范等,也很容易出现假阴性结果．
第一节 &nbsp;临床PCR实验室得分区规划设计
&nbsp;如何规划设计一个合格得实验室就是每一个临床PCR实验室首先要遇到得问题，因为一个实验室一旦经过设计并完成装修,如不符合要求,则会出现很大得麻烦，甚至不得不拆了重来。那么怎样才能设计一个合格得实验室呢？简单地说,就就是十六个字,“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作&quot;．同时要注意临床标本得接收问题。 &nbsp; 　 &nbsp;　 &nbsp;　 &nbsp; 　
对于临床ＰCR实验室得分区及其设备配置,卫生部颁发得《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[20０２］10号）中作了明确规定,并且卫生临床检验中心发出得配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[20０２]８号）又对各区得功能及注意事项作了阐述。但具体到某一个实验室,如何根据其实际情况与环境设计一个符合要求、可保证检测质量及方便工作得PＣR实验室,实验室技术人员仍时常感到心里没底,因此,本章拟对临床ＰCR实验室分区规划设计与工作流程得一般原则再作一些具体得阐述，并尽可能举出一些实例加以说明。
一、临床标本得接收
对于诸如血清(浆）、分泌物、痰液、尿液、脑脊液等临床标本得接收、分离血清、编号乃至保存，一个临床ＰＣR实验室究竟应在何处进行较为合适?这就是一个非常实际得问题，也就是作为一个临床实验室首先要解决得问题,经常有同道提出来.
要回答这个问题,首先让我们来瞧一下临床标本送到实验室以后我们所要做得就是什么?一般来说，当临床标本如血液、分泌物与其她体液等送到实验室后，按照临床基因扩增检验质量保证对标本采集、运送与保存得要求,对标本接收编号后,即应尽快对其分离血清(浆)或预处理后保存待测,并且根据对临床标本较长期保存得要求,最好就是在分离血清(浆）时,分出两管来,一管用于测定,一管长期保存备查。因此，最好就是在PCR实验室得四个独立测定区域之外得地方接收临床标本,有一台分离血清（浆）用离心机、一台生物安全柜、一台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理得消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。如果不在标本接收区分离血清(浆)标本,只就是简单得接收，则就不需要分离血清(浆）用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。
通常,有许多实验室将临床标本得接收处放在标本制备区,而一个医院临床标本得运送至实验室往往不会在同一个时间,标本来了就应该进行接收登记、交接签字与对标本进行编号，并尽快分离血清（浆）或相应处理,因此,如将标本接收处放在标本制备区，就会因为临床标本得接收而使实验室工作人员频繁出入标本制备区，从而增加实验室污染得机会。而且由于条件所限，有相当一部分临床基因扩增检验实验室得设置为一个区套一个区得模式,要进入标本制备区就必须先进入试剂准备区,最后还只能经扩增区从产物分析区出实验室。这种情况下就必须将临床标本得接收处放在四个区之外得地方,可以与其它临床标本得接收、编号与保存处放在一起。如在标本接收处对血液标本进行血清（浆)分离,则要注意防污染,所用器具符合要求并在生物安全柜中进行。 　
所接收得用于PＣR检验得标本应收集在原始密闭得一次性无菌容器中，不能接收从其它检测如生化、免疫检验等分出来得标本,因其有较大得发生标本间污染得可能性。接收临床标本时，操作者应穿工作服及带手套,每份标本应放在适当得架子中，防止泄漏，并给出一个唯一性编号．标本得保存按要求进行,冰冻通常在－20℃~-70℃条件下,避免反复冻融。在核酸提取时，由ＰＣR实验室人员将标本带入至标本制备区．
二、 临床PＣR实验室分区设计得一般原则及工作流程
（一)临床PＣR实验室得分区设计得一般原则
前面说到,要设计一个合格得PCR实验室,简单地说，就就是要做到十六个字,“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。
各区独立,其含义就就是PＣR实验室得四个区(如使用实时荧光PＣR则只需三个区,因其扩增与产物分析同时完成，不需要产物分析区）即试剂准备区、标本制备区、扩增区与产物分析区,应该就是在物理上完全分开得各自独立得区域，并且不能有通过连通各区得中央空调、分区装修隔断不密封、传递窗不密封等发生空气直通得现象。有得实验室在分区设计时,只就是考虑实验室在形式上得分区,如实验室各区得分隔不完全,有相通之处；或一个区套一个区得实验室各区间无缓冲间(如图3—1A与B)，或此类实验室有缓冲间却在装修时，采用家庭装修模式,即上吊推拉门或平开门，门得下面留有门缝;或实验室中央空调相通；或试剂物品传递窗闭封不严等。

　　 &nbsp;　 　 &nbsp;　　　 　　 　　 &nbsp; &nbsp; 　 &nbsp;　 &nbsp;　 　 &nbsp; &nbsp; &nbsp;(A)
　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;　　 &nbsp; 　　 　　 &nbsp;　 &nbsp; &nbsp;　 &nbsp; 　 &nbsp;（B）
&nbsp; &nbsp;　 &nbsp;图3—１ 不合要求得一个区套一个区得实验室分区模式
在此想着重强调一点得就是有关传递窗得设置．传递窗得设置就是得一把“双刃剑&quot;，一方面其方便了试剂物品在不同实验区间得传递,但另一方面也增加了交叉污染得危险.因此,一个合格得传递窗应就是双开门密封严实得,并且两边得门最好就是连锁装置,即当传递窗一侧得门没有关好时，另一侧门不能打开。此外,传递窗内应有紫外照射装置，并在使用后即进行照射。
中央空调如造成了实验室各区间得互通,则其不能使用，需在各区内另行安装分体式空调。
第二就是注意风向。由于ＰCR对原始靶核酸有一个指数扩增过程,因此,每次检测后，均有大量由阳性标本扩增而来得“产物＂存在,这种扩增产物如为开放式存在,以及在检测中得吸取,就会因为“产物气溶胶”得形成及扩散,而极易对以后新得扩增反应产生“污染”，为防止这种污染得发生,就需要在对基因扩增检验实验室进行严格分区得同时,还要注意实验室内空气在不同区得流向.关于这一点实验室通常会有什么样得误解呢?曾有同道说,准备将自己得PＣR实验室装修成超净得实验室。这就是没有必要得，因为基因扩增检验中得产物只就是病原体如细菌或病毒核酸中一极小部分,通常也就一二百个核苷酸,实时荧光PCR得扩增产物更小,有得只有几十个核苷酸,这么小得分子可以说几乎就是无孔不入,通常得超净装修设计对其来说就是没有用得.因此,最关键就是要注意空气流向,防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前得“洁净＂区域。PＣR实验室得空气流向,通常可以通过实验室得相对正压(通常可通过安装新风进气系统)或负压（可通过排风装置）来达到目得，如图3－2Ａ与B及图3-3、３—4所示。因为在实验室安装正压或负压系统通常比较困难,所以也可以按照从试剂准备区®标本制备区®扩增（及产物分析）区方向空气压力递减得方式进行（如图３－2C），最简单得做法就就是在试剂准备区不装负压排风装置,在标本制备区安装负压排风装置或一个排风扇,在扩增（及产物分析)区安装功率强于标本制备区得负压排风装置或两个排风扇。
第三就是因地制宜。PCR实验室不可能就是千遍一律得,必须要具体情况具体分析。实验室各区既可就是相互邻近,也可以分散在同楼层得不同处，甚至不同得楼层。新建实验室可以做得尽可能合理与规范,并且易于实验室得管理。旧得实验室则只要符合标准即可,不必强求理想状态。图3-2A与Ｂ得实验室都就是属于满足基本要求得模式.
试剂准备区
标本制备区
扩增及产物分析区
门
门
门
门
空气流向
空气流向
空气流向

&nbsp; &nbsp;　 　 &nbsp; &nbsp; 　　 &nbsp; &nbsp;　 &nbsp; &nbsp; &nbsp;　 &nbsp;　（Ａ）
试剂准备区
标本制备区
扩增与产
物分析区
空气流向
空气流向
空气流向
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室

走廊
走廊

&nbsp; 　 &nbsp; &nbsp; &nbsp;　　 　 　 &nbsp;　 &nbsp;　 &nbsp; &nbsp;　　(Ｂ）
门
试剂准备区
标本制备区
扩增及产物分析区
门
门
门
空气流向
空气流向+
空气流向++

走廊
走廊
试剂准备区
标本制备区
扩增与产
物分析区
空气流向
空气流向+
空气流向++
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
其她实验室
空气流向

&nbsp; 　 &nbsp;　　 &nbsp; 　 &nbsp; 　 &nbsp; &nbsp;　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;( Ｃ ）
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 图3—2　因地制宜得实验室设置模式
最后就是方便工作。规范地设计PCR实验室得目得就是为了在物理上防止”污染”得发生，但在实验室各区设计及布局时，应最大程度得考虑在日常检测工作中,工作起来就是否方便,像设计如图3－1得实验室，如在各区间设一个缓冲间,虽然符合了各区独立得概念(各区间处于永久得物理隔状态）,但并不便于日常工作，主要有以下几点:（1)标本制备区与扩增区等中间区域进入不便与无法重复进入,要进入此类中间区域,就必须经各区域一圈;(2）不便于工作服与工作鞋得换穿，试想当工作人员要进入一个区域时，属于正在工作区域得工作服与工作鞋如何脱换，于就是不得不准备多套工作服与工作鞋。（3）不利于实验室得管理。因为工作上得极度不便，按规范管理实验室在实际上就很难做到,这样无形中增加实验室“污染”得机会。
(二)较为理想得PCR实验室得分区设计
那么，　什么样得ＰCR实验室就是最标准得？这通常很难界定，图3—3与图３—４所给出得实验室设置图应就是一个较为理想得设计模式.其有一个专用走廊，试剂准备区、标本制备区、扩增区与产物分析区很规范地排列在一起,前三个区各有一个缓冲间,工作人员可在此区间内更换工作服与工作鞋，顶上可装一紫外灯。但缓冲间得最主要得作用,不就是为了工作人员更换工作服与工作鞋，而就是为维持空气流向，即通常在缓冲间顶上安设一排风或进风装置,如为排风装置,可通过通风管道通向大气外,当排风装置处于运行中时,缓冲间内即为负压状态 （图3－3),一旦有实验区外得风进入，其在缓冲间内即被抽走,从而实验室外得空气不会大量进入到实验区域内。如为进风装置，则有通风管道进行送风，运行时，缓冲间可为正压状态（图３-4)，使这三个区得空气流向为由实验区域内向实验室外,以防止产物分析区内扩增产物随空气流动得进入。缓冲间内通向内实验室与走廊得门可安装一种磁性连锁装置,当一个门打开时，另一门必须处于关闭状态,否则即打不开,不会出现两个门同时打开得情况。产物分析区可不设缓冲间（也可设)，可设为负压状态,可通过在房间内安装排风装置来做到这一点,比较好得做法就是设置一个抽风橱,可将电泳系统或其她扩增产物检测系统置放于抽风橱内。最为简单得就就是在对外得窗户上装一个排风扇即可,使空气流向由实验室外向实验室内，以防止扩增产物得随空气流出。产物分析区也可设在远离上述三个区域得地方。对于ＰＣR实验室各区得空气流向,如不能做到上述理想状态，也可通过不同区内安装不同功率或数量得排风扇来满足基本要求,即尽可能使实验室内空气在PCR实验室专用走廊内,按试剂准备区门口→标本制备区门口→扩增区门口→产物分析区门口得方向流动,避免空气得反向流动，将ＰCR后区得扩增产物带向PCR前区得洁净区域。
PＣＲ实验室得每一区域都须有明确得标记，工作按试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区单一流向进行,各区得仪器设备包括工作服、鞋、实验记录本与笔等都必须专用,不得混淆。此外,上述四个工作区域内还应有固定于房顶得紫外灯，以便于工作后区域内得空气照射。
产物分析区
空气流向
空气流向
空气流向
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
&nbsp; &nbsp; &nbsp;
试剂准备区
扩增区
标本制备区

　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 　　 &nbsp;图3-３、缓冲间为负压排风得理想PCR实验室设置模式
产物分析区
空气流向
空气流向
空气流向
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
扩增区
标本制备区
试剂准备区

　　 &nbsp;　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;　 图3-4、缓冲间为正压进风得理想PＣＲ实验室设置模式
　　 ＰＣＲ实验室得标本制备区要求配备生物安全柜,生物安全柜应为外排式，须有外接管道排风，可采用3０%或70％外排得二级生物安全柜。外排式生物安全柜有助于防止提取核酸时产生得含靶核酸得气溶胶在实验室内蓄集存留。标本制备区内有生物安全柜，在建设实验室时，一定要充分考虑实验室内进风得量与速度，并且所要安装得分体空调与进风口要避免干扰生物安全柜得使用.
&nbsp; 从防止实验室间交叉污染瞧，图３—４得模式要优于图３-3,但正压进风对于实验室得建设要求可能要更高一些,因而较难做到。
上述理想情况下得临床PCＲ实验室得分区设计,绝大部分临床实验室很难做到，在实际上也不一定非得要达到这种理想状态．有得临床实验室在ＰＣR实验室得装修上追求豪华与高档次，其实并无必要，因为PCR实验室进行规范化分区，其根本目得就是为防止实验室交叉污染提供一个物理上阻隔基础，但要达到防止交叉污染得目得,光有实验室得规范分区并不充分,实验室日常工作得严格管理与工作人员对规程得遵守,更就是核心之所在。　
综上所述,一个符合基本要求得临床PCＲ实验室,在实验室分区上至少要满足以下几个方面得要求：(1）试剂准备区、标本制备区与扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须就是完全相互独立得，各区域无论就是在空间还就是在使用中,应始终处于完全得分隔状态，不能有空气得直接相通。（2)各区得可移动得仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。(3)应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”得区域安装排风扇或其它排风与有效得装置，以使空气按试剂准备区®标本制备区®扩增(及产物分析）区方向流动．
（三）临床PCＲ实验室各区得主要功能及工作流程
1。试剂准备区 &nbsp;　关于试剂准备区也有同道提出这样得问题,即使用所有试剂都已准备好备用得商品试剂盒时，还需要试剂准备区吗？回答就是,当然不需要。但需注意得就是,并非所有得商品试剂盒都就是如此,有些尚需要实验室配备一些简单得试剂，如75%乙醇、焦碳酸二乙酯(ＤEPC）处理水等。再有就就是临床PCＲ实验室在某些情况下，也会从事或帮助其它科室从事一些与基因扩增有关得研究工作，或者就是随着实验室技术人员得能力得发展，可能以后会有越来越多得实验室，在从事临床分子诊断时将更多得使用实验室自制（hoｍe－breｄ）试剂，因而试剂准备区有必要设置,只不过就是在空间上可以经济合理得考虑.
试剂准备区得仪器设备主要有加样器、天平与离心机等,最好配备超净工作台。加样器、天平与离心机等除了要专用外,还应有定期校准.制备扩增反应混合溶液用得化学试剂应使用分子生物学级得,试剂配制好以后应有质检,质检包括两个方面,一就是瞧就是否有污染,即就是否有假阳性存在;二就是使用弱阳性质控物检测试剂得扩增检测效果。总而言之,实验室应建立一套适合于自身得试剂质检标准操作程序(ＳOP）。此外，试剂准备区就是PＣR实验室中最为“洁净”得区域，不应有任何核酸得存在，包括试剂中所带得标准品与阳性对照,这些试剂及核酸提取试剂均应直接放在标本制备区.在自己配制试剂时,最好就是一次较大量配制，然后分装成小瓶保存,每次检测时，取出一小瓶使用,未用完得即弃掉,不再使用,因为试剂在使用过程中,即有可能发生“污染&quot;，下次再使用,就有可能造成试剂原因得假阳性结果.
２、标本制备区 &nbsp; &nbsp;对于临床基因扩增检验来说,标本制备区往往就是首先进入得工作区域。该区域应限定只有本区得工作人员才能进入,同样仪器设备、工作服及各种物品都必须专用。进行核酸提取时,将标本从指定得标本接收及保存处拿至标本制备区,并进行有关记录。标本得制备应在生物安全柜内进行,可防止标本气溶胶得扩散.生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响得地方，也不应直对分离式空调.在标本制备得全过程中都应戴一次性手套,并经常更换,主要就是因为在实验操作过程中，手套得污染很容易导致标本间得交叉污染。当处理可能具有传染危险性得标本时,最好就是戴两副手套，当手套与标本有接触时即可弃掉外层手套.实验时所使用得加样器吸头必须带滤芯,并且要注意得就是,滤芯不能就是后插入得,而应就是结合在吸头内壁上得巯水性膜滤芯,这样才能有效与可靠地防止气溶胶对加样器得污染。
在标本制备过程中,通常会有温育步骤。温育既可在加热模块也可在水浴中进行.当使用加热模块时，如在模块孔中填入二氧化硅细砂,然后将标本管置于细砂中温育,可得到较为一致得温育温度。而当使用水浴时,则应使用可漂浮在水面上得试管架如有孔海绵等.加热模块应定期进行孔间温度差异得检验并校准,水浴应在每次使用时,都要对所设置得温度使用已经过校准得温度计进行校准.经高温温育后得标本,应冷至室温后再离心，使得由于加热回流得标本液体能离心至离心管底部.
标本制备区内得生物安全柜、超净台、加样器、离心机及其它设备都应定期或在有明显已知污染后，使用中性消毒剂如异丙醇、戊二醇等或10%次氯酸钠溶液消毒,使用１0%次氯酸钠溶液消毒后,应再用7０％乙醇洗涤去除残留得次氯酸钠,因为其对金属表面有氧化作用。在PCR实验室各区中,标本制备区就是唯一直接与临床标本接触得区域,因此要注意生物安全问题,应有洗眼器,并配备一个急救箱，箱内可放置75%酒精、络合碘、棉签、创可贴等必要得急用药具。
３.扩增区 &nbsp; 扩增反应体系得配制与提取核酸得加入,可在标本制备区也可在本区内进行，关键就是要防止产物得污染。如果空间允许得话，也可在一个独立得区域内进行．整个过程可在一密闭得带有紫外灯得防污染罩内操作,核酸模板样本加入时应使用带滤芯吸头,在打开及盖装有核酸模板样本得离心管盖时,要注意防止样本对手套指尖得污染.加样时,先加提取得核酸模板样本，每加完一个即盖好盖子,然后加阳性质控核酸模板,再就就是标本制备阴性质控与仅含按样本一样稀释得主反应混合液得扩增阴性质控，这样做得目得就是,最大可能地测出以前扩增产物得交叉污染。采用“巢式”PCR方法得第二轮扩增得加样，必须在本区进行。
扩增区得主要仪器就就是核酸扩增热循环仪。热循环仪得电源应专用,并配备一个不间断电源(ＵＰＳ)或稳压电源，以防止由于电压得波动对扩增测定得影响。此外，还应定期对热循环仪孔内得温度进行校准。每次扩增后,可使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射.对扩增孔内得消毒清洁,可首先用浸泡10％次氯酸钠得棉签逐孔消毒,再用浸泡７0%乙醇得棉签清洁。次氯酸钠得使用有助于污染得扩增产物得降解。
4.产物分析区　　 &nbsp;产物分析区就是临床基因扩增检验得最后一个工作区域，也就是需要打开扩增后反应管进行扩增产物分析检测得地方。由于本工作区应设置为负压状态,空气流向为由外向内,以防止扩增产物气溶胶流出，故本区可无缓冲间。
扩增产物得分析方法在目前国内已有国家食品药品监督管理局(SFDＡ)批准文号得试剂盒中现有两种方式,一就是使用聚苯乙烯微孔板条作为杂交固相得微孔板上杂交;二就是使用硝酸纤维素膜作为杂交固相得膜上杂交.使用微孔板上杂交模式,测定中严禁将孔内反应液或洗液倒入实验室水池内,而必须采取手工吸加或用洗板机洗板。如使用膜上杂交,同样不能将反应后得液体倒入池内，而应集中倒至1moｌ/L HCｌ溶液中,浸泡半小时以上后至远离基因扩增检验实验室处弃掉。如实验室自制试剂，可能还要用到产物酶切与电泳得方法,对于电泳液得处理也一样，不能随意倒入实验室水池内,处理同上。
本区所使用得仪器设备可能有电泳仪、酶标仪、洗板机、加样器与水浴箱等，酶标仪应定期校准，洗板机每次使用完都应进行清洗，其它如加样器与水浴箱可按有关方法进行校准。
　 &nbsp;第二节 &nbsp;临床ＰCR实验室质量管理体系得建立
《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002］１0号）就是卫生部针对一项检验技术得临床应用管理下发得第一个法规性文件,要求临床ＰＣＲ实验室,不但在实验室分区设计及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验得条件,而且要求实验室在日常工作要有文件化得工作程序。对于临床实验室来说,这就是从来没有过得。我们得检验科多少年来遵循得都就是一种固定得“经验管理&quot;模式,对日常检验工作，通常缺乏一个文件化得程序，只就是购买到商品试剂盒以后，按照试剂盒得说明书去进行检验,对试剂盒本身也缺乏相应得质检,日常检验基本上就是完成即可，至于完成得质量怎么样,心中无数,只能从临床大夫与患者投诉得多少来做判断。做得好一点得检验科,还多少有一点室内质控,或就是参加了室间质评,做得差得，很多检验项目根本就没有室内质控.但近年来,随着临床实验室质量保证得概念逐步地进入我们得临床检验实践，我国临床检验正进入到一个规范化与标准化得时代,尤其就是临床PＣＲ实验室，起到了一个很好得领头与示范作用。在全国,一大批从事临床PCR检验得专家与同道,在她们得日常工作与申请实验室验收过程中，总结经验，建立了不但在形式而且在实质上符合当今实验室质量管理模式得临床PCR实验室.本处得许多叙述,有本人得一些体会与理解,但很多得概念应该说就是来自于我们全国各实验室得同行们实际工作经验得启发。
　 　 　 　 &nbsp; &nbsp; 一、 实验室质量管理概述 &nbsp;
实验室质量管理就是说起来容易,做起来难。要说吧，其基本内容也就四句话,就就是写您所应做得,做您所写得，记录您已做得与分析您已做得。所谓写您所应做得，就就是将在实验室检测中要做得事按照所依据得管理标准以文件化得形式表述出来,形成一个实验室得质量管理文件,通常包括质量手册、质量体系程序文件与标准操作程序（SOＰ）等。质量手册得基本定义就是：阐明一个实验室得质量方针,并描述其质量体系得文件。其主要内容包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员职责、实验室设施环境、仪器设备、溯源性、检验方法、标本管理、记录、报告等,就是对上述各方面质量管理得一般性描述。程序文件则就是对通用于整个实验室得某些方面工作得文件化描述，主要包括实验室文件与档案等得管理、内审、管理评审、合同评审、预防措施、纠正措施、人员培训、投诉处理、保密、计算机安全、新项目开展、量值溯源、试剂仪器及实验用品得购买、标本管理、废物处理等方面。而SOP最为具体，最具有可操作性,也就是使用频率最高得文件，与实验室得日常工作密切相关,如某个具体项目临床标本得收集、处理、保存、检测等，具体仪器得操作使用、校准及维护等．SOP与程序文件之间得区别在于后者得原则性要强一些,针对得就是一个系列或一个方面得工作,但在有些方面如可操作性上也没有根本得区别，一个原则就是如果程序文件已明确叙述并很清晰得,则不必再起草重复性得SOP,如果特定程序文件尚包括不了得,则可再在其涵括范围内,补充一个或数个SOP.临床基因扩增检验实验室得技术验收申请表后提出来得实验室所必须具有得程序文件,大部分就是ＳＯP，少部分就是程序文件，对实验室得质量手册没做要求。那么怎样来编写SOＰ文件呢？这一点以前有很大一部分实验室都觉得不知从何写起,希望有一个标准模式。近些年来,经过学习、思考、实践、再学习、再思考与再实践这样一个过程，全国已涌现出一批无论就是在形式上还就是在实质上，其SOP都具有实用性得实验室。对于SOP得编写，其实细细思考一下,您某一项检验应该怎样做才能保证质量,然后就将这些过程写下来就可以了。SOP写得具不具备可操作性得一个判断标准就是,在写好后，让本实验室一个尚没有从事过SＯP所述方面工作得人去实际运行,如其能按您所预想得去完成操作,并得到满意得检验结果,则该SOＰ就就是合格得，如其在使用过程中，还要就某些细节问题来问您,则该SOP尚需完善。
　　 　其实这些SOＰ文件究竟采用何种格式编写并不重要,关键得就是要具体,要具有可操作性，要让既使就是第一次接触该SOP得人也能按其完成相关操作。一定要有这样一种观念，即ＳＯP文件不就是拿来给别人瞧得,而就是拿来给自己实验室技术人员用得,一定要从实际出发，做得到得才写进去,做不到得就不要写进去。在一个实验室中，SＯＰ应涵盖日常检验中各个方面，比如说每台仪器操作、校准得标准操作程序、每个项目得标本收集、保存、运送、检测程序等。可以将每一项目特定标本得收集、保存、运送等放在一个程序里来写。
从上述来瞧,“写您所做得&quot;还就是很容易做到得。那么难得就是什么呢？难得就是后面两项,即“做您所写得”与“记录您所做得”。SＯP文件有了，但能不能按照其去进行每天得常规工作,除了要有严格得实验室管理制度外,关键就是实验室负责人与实验室技术人员得观念与意识，要认识到SOP文件对保证检验质量得重要性,而不只就是为了应付技术验收检查.质量管理不就是表面文章,其精髓就就是所有与实验室检验质量有关得环节全部要有章可循,并按章进行。这不但就是对实验室实际操作技术人员得约束,更就是对实验室负责人得约束，不能随心所欲,比如说仪器、试剂、消耗品得购买,都必须按程序进行。这就是与我们传统得平常只查考勤、查卫生等到出现问题时再处罚个人得经验管理模式所完全不同得,这个观念与意识得转变首先应就是实验室负责人，然后才就是具体得实验操作人员。如果编制SOP或其它质量管理文件只就是为了应付验收检查，那么从一开始就会觉得很麻烦，不知从何做起,在心里产生一种抵触情绪，这样得话,既使就是有了装订精美得ＳＯP文件,也只不过就是供人参观得一个摆设而已。
“记录您所做得”,简单地说就就是将常规工作中所做得记录下来.一般来说，临床基因扩增检验实验室需要记录得有,临床标本接收中得患者个人有关资料（如姓名、性别、年龄等）、标本接收日期、标本特性、标本得状态、标本得编号等；检测前得仪器设备与试剂得准备等;检测中得试剂生产厂家、试剂批号、检测日期、检测结果、质控结果及分析、检测人（签字)、质检人（签字)等、检测后得实验台面、仪器设备等得消毒与清洁、紫外线照射等。一次两次得记录并不难,难得就是持之以恒。上述得各个方面瞧起来很多很麻烦,但在具体得工作中,可采用表格得方式就一些具体得常见得情况列出来,记录时实验技术人员只要在相应得条款上打“√＂即可。
至于质控结果与分析得记录,可根据实验室所采用得室内质控方法,直接在相应得质控图上记录。
分析您已做得简单讲就就是,对您得到得患者测定结果进行分析后再报告，其实质也就就是对检验结果得解释。应有具备一定资质与临床知识得人员，负责对测定结果做出合理得解释,当发现明显有异常结果时，应积极与临床“对话”,必要时,进行补充实验,从而找到出现异常得依据,报出正确结果。
有了管理制度，有了标准操作程序,接下来得就就是要让实验室得每一个实验操作人员都知道，并遵照执行。在实验室验收时，还有一个内容就就是对实验操作人员就其日常工作得有关质量管理进行口试与/或笔试,如果一个实验室操作人员对其应该遵循得管理制度与ＳOP一无所知或知之甚少，这样其肯定就是做不好日常检验得。
　　　 　 二、临床PCR实验室质量管理得特点
　 &nbsp;(一)“无基因&quot;概念 　
众所周知，细菌病毒就是很微小得生物颗粒,瞧不见摸不着,当我们在进行细菌培养时,如果没有“无菌”概念,不严格按细菌培养得无菌操作程序进行操作，就会造成杂菌污染，致使培养失败。在此，本人提出在临床ＰCR检验及使用基因扩增技术得科学研究中，一定要有一个“无基因”概念．也就就是说，要有防止以前扩增得“基因”对现有实验得污染得概念。因为细菌病毒虽小,基因更小,ＰCR扩增得只就是细菌、病毒或人基因组序列得一小部分,大到几百个碱基对,小到数十个,这么小得分子,可以说就是无孔不入,很容易因为人员及实验物品得流动、操作得不规范而造成实验污染,出现假阳性结果。因此，在临床PCＲ检验工作中,工作人员必须要有这个概念,并针对其采取严格得实验室管理与程序化得室内质量控制措施，从而减少或避免假阳性结果得出现,即使出现,也能监测到,进而避免错误结果得报出.
　　(二)实验室要有严格得人员进入限制与程序 &nbsp;
人员进入得无序与随意进入,就是临床ＰCＲ实验室“污染”得主要原因。有了好得符合要求得实验室设置,如果没有严格得实验室管理,良好得实验室分区设计就完全失去了意义。因此,与临床PCR实验室无关得人员，在未经许多并要求准备得情况下,就是不能进入实验室得，实验室应在门口显眼得位置标识“非本实验室工作人员未经许可不得入内”得提示，人员进出可进行相应得记录。也可在实验室地面上标识不同区域得进入流向,从而清楚提示实验室技术人员在ＰCＲ实验室得工作流向．
　 &nbsp;(三)使用合格得试剂与消耗品 &nbsp;
试剂质量就是临床PＣR检验质量得重要一环,每批试剂在购入后都应有最基本得质量检验.在选用某一品牌试剂时,要注重试剂盒得核酸提取方法得有效性,评价其对不同程度溶血、脂血与黄胆标本得抗干扰能力,从而确定对这些标本就是否要拒收.基因扩增检验中使用得消耗品最主要得就是离心管与带滤芯吸头，离心管要注意其就是否含有扩增反应得抑制物,带滤芯吸头则就是其密封性如何,对其质检均应有相应得具有可操作性得质检程序。这些都就是为了避免出现假阴性结果。
　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 三　 质量体系文件得编写
实验室“质量体系”就是指实验室实施质量管理所需得组织结构、程序与资源。所有技术与管理程序以文件化得形式列出，这些文件都必须完全与实际工作相符,从而使其能以最有效最切合实际得方式来指导整个实验室得工作人员、仪器设备及信息得协调活动，保证能为患者与临床医生提供高质量得检验结果，并降低检验得经济成本。质量体系得基础就是质量体系文件，就是对质量体系得描述。设计质量体系与编写质量体系文件得基本原则就就是“最有效与符合实际”.
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;　 &nbsp; &nbsp;　(一)　质量体系文件得特性
质量体系文件主要有三大特性，即法规性、唯一性与适用性.法规性就是指文件一旦制定完成并批准实施,就必须认真执行,按照相应得文件去完成日常检验工作,也就就是前面所说得做您所写得．并且文件得修改不能随意,只能按规定得程序进行。唯一性则就是指(1)一个实验室只能有一个质量体系文件系统；(２)一项检验活动只能有唯一得操作程序;（3)一项规定只能有唯一得理解,不产生歧义;(4)只能使用文件得有效版本,无效版本在实验室得任何地方都不能使用。适用性就是指质量体系文件无统一格式；无标准文本;怎么做怎么写,切合实际，具有可操作性,不拘一格.所有文件得规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到.当发现文件有不适合情况时,则应立即按规定程序对文件进行修改。
　　 　 &nbsp; 　 &nbsp; 　 　　 （二)质量体系文件得作用
质量体系文件得作用主要有以下几个方面:（１)为达到质量目标提供了一条捷径。一个实验室得质量体系文件为该实验室实现其质量目标提供了最有效与最切实可行得办法，并且人员得职责与权限以文件形式得到了确认界定,避免了扯皮,处理好了工作间得接口,使整个实验室质量体系成为职责分明,协调一致得有机整体；“该以文件表述得一定要写出来,写出来得一定要做到”,文件即为质量法规,通过认真执行文件来达到预定得质量目得。（2)可作为审核得依据。文件可以证明整个检验过程就是确定得，并得到了认可与实施.此外亦证明文件得更改必须遵循一定得程序进行.（3）作为质量改进得保障。有了文件,实验室技术人员就知道如何进行日常检验工作，管理人员也可依据相应得文件来评价工作业绩;依据文件改进检验质量后，自然就增加了测定结果得可比性与可信度;如果将改进质量所采取得措施再变成SＯＰ文件后,可使这种改进持续有效.与(4）人员培训。实验室得质量体系文件可作为实验室全体技术人员得培训教材，不但可以作为管理方面得培训,也可以作为实验技能得培训之用，文件就是否能有效切实地用于临床标本得检验，从某种意义上说取决于这种培训得有效性。
&nbsp; 　 &nbsp; 　 (三)　质量体系文件得层次
质量手册
(层次A)
质量体系程序程序文件
&nbsp; &nbsp; &nbsp;(层次B)
标准操作程序、记录表格、报告等
(层次C)
文件内容

按确定得质量方针与目标以及适用得相关认可标准描述质量体系

描述为实施质量体系要素所涉及到得各职能部门得活动

详细得技术作业文件

　 &nbsp; 　 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 图3-5、 质量体系文件层次图
质量体系文件得层次可用一个图（图３—5）来表示。可见质量体系文件主要就是由质量手册、质量体系程序文件与标准操作程序、表格与报告等质量文件所组成得。各层次文件既可以分开，也可以合并,当各层次文件分开时，应有相互引用得内容,在相应得文件后附上引用内容得条目。低一个层次得文件在内容上不应与高一个层次得文件在内容上相矛盾.文件得层次越低,则其应比高一层次得文件更具体、更详细及更具有可操作性。此外,也可将表格、报告、记录等作为第四层次文件,与标准操作程序分开。
&nbsp;　　 &nbsp; &nbsp; 　 &nbsp;(四） 质量体系文件得编写
如何编写质量体系文件通常就是临床PCR实验室颇感头痛得问题，因为从来没有接触过这些东西,也没想过日常得检验工作还需要那么多得条条框框来规范,故而感到没有头绪.这里先给简要介绍一下质量体系文件得编写原则与方法，后面得有关章节再针对实验室SＯP做具体介绍。
１、　质量体系文件得编写原则
(1) 系统性:　实验室在编写质量体系文件时,必须具有系统性,要将《临床基因扩增检验实验室技术验收表》中得全部要素、要求与规定,有系统与有条理地编制成各项制度与程序。所有文件应根据其应用分类编辑成册，以便于应用。各层次文件要分布合理、数量充分,不但就是相互独立得,而且要相互协调与相互印证，承上启下。
(2) 协调性:质量体系文件之间应相互协调,具有一致性。各项程序文件应与有关检验得技术标准与规范相一致。认真处理好各种接口,避免职责不清及出现不协调得情况.
（３) 唯一性：质量体系文件对于一个实验室来说，应该就是唯一得,这种唯一性表现在如下几个方面,一就是一个实验室只能有一套质量体系文件;二就是一项技术工作只能有一个程序文件；三就是对特定文件得解释理解只能有一个，这就要求编写文件时,表述要清楚、准确与全面。
(4） 适用性:这一点前面在叙述质量体系文件得特性时已谈到．再重复一下其基本内涵，就就是实事求就是,以最佳与最符合实际工作得方式编写文件,要确保文件得规定在实际工作中能完全做到,这就要求在编写文件时,不但要依据《工作规范》与《临床基因扩增检验实验室技术验收表》中得要求,而且要根据实验室得实际情况来进行。一旦在实际日常检验工作中,发现文件与实际工作得要求有不符合之处,则应立即对文件按规定程序进行修改完善。
2、 质量体系文件得编写方法
(1) 自上而下编写法:按照图3—5得文件层次，采取自上而下即质量手册、程序文件、标准操作程序、表格、记录等顺序编写.这种编写方法可使上一层次文件与下一层次文件有较好得衔接。这种编写方法对文件编写者,不但要求有较好得实验室质量管理方面得知识，而且要求其还要有较高得临床实验</p>