临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立.doc
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1、临床PC实验室得设计及质量管理体系得建立 卫生部临床检验中心核酸(DA与NA)就是生命现象得基础。小到病毒、细菌等微生物,大到动植物与人类,都无一例外.因为主导生命活动得受体、细胞因子、酶、激素等均不过就是核酸发挥功能作用得表型,均由核酸决定,在核苷酸序列上哪怕就是单个碱基得变异,都会引起表型得完全改变,并进而影响生命功能得发挥,导致疾病得发生。因此,在核酸或称为基因水平上检测,对临床疾病本质得揭示就要更深一步。也正因为核酸就是生物体生命活动之源,对于感染性病原体得检测,从核酸着手,最能反映病原体在机体内得出现与消长自从美国Ces公司Mullis博士在193年发明聚合酶链反应(P
2、R)这种核酸扩增技术以来,由于其极高得检测灵敏度与特异性,因而在临床感染性疾病、遗传病、肿瘤等得诊断与疗效观察上得到了广泛得应用,在器官移植得基因配型上也就是难以替代得技术。其应用大大提高了上述疾病诊断得准确性与快速性.但临床PR检验必须按规范要求进行,并有严格得实验室质量管理,否则,因其极高得检测灵敏度,实验室稍有以前扩增产物得污染,或在标本核酸提取过程中标本间得交叉污染,均可导致假阳性结果得出现。同时,也会因为试剂与实验消耗品得质量不过关、仪器设备得维护校准不到位,或操作得不规范等,也很容易出现假阴性结果第一节 临床PCR实验室得分区规划设计 如何规划设计一个合格得
3、实验室就是每一个临床PCR实验室首先要遇到得问题,因为一个实验室一旦经过设计并完成装修,如不符合要求,则会出现很大得麻烦,甚至不得不拆了重来。那么怎样才能设计一个合格得实验室呢?简单地说,就就是十六个字,“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作"同时要注意临床标本得接收问题。 对于临床CR实验室得分区及其设备配置,卫生部颁发得临床基因扩增检验实验室管理暂行办法(卫医发2010号)中作了明确规定,并且卫生临床检验中心发出得配套文件临床基因扩增检验实验室工作规范(卫检字20号)又对各区得功能及注意事项作了阐述。但具体到某一个实验室,
4、如何根据其实际情况与环境设计一个符合要求、可保证检测质量及方便工作得PR实验室,实验室技术人员仍时常感到心里没底,因此,本章拟对临床CR实验室分区规划设计与工作流程得一般原则再作一些具体得阐述,并尽可能举出一些实例加以说明。一、临床标本得接收对于诸如血清(浆)、分泌物、痰液、尿液、脑脊液等临床标本得接收、分离血清、编号乃至保存,一个临床R实验室究竟应在何处进行较为合适?这就是一个非常实际得问题,也就是作为一个临床实验室首先要解决得问题,经常有同道提出来.要回答这个问题,首先让我们来瞧一下临床标本送到实验室以后我们所要做得就是什么?一般来说,当临床标本如血液、分泌物与其她体液等送到实验室后,按照
5、临床基因扩增检验质量保证对标本采集、运送与保存得要求,对标本接收编号后,即应尽快对其分离血清(浆)或预处理后保存待测,并且根据对临床标本较长期保存得要求,最好就是在分离血清(浆)时,分出两管来,一管用于测定,一管长期保存备查。因此,最好就是在PCR实验室得四个独立测定区域之外得地方接收临床标本,有一台分离血清(浆)用离心机、一台生物安全柜、一台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理得消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。如果不在标本接收区分离血清(浆)标本,只就是简单得接收,则就不需要分离血清(浆)用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。通常,有许多实验室将临床标本得接收处放在标
6、本制备区,而一个医院临床标本得运送至实验室往往不会在同一个时间,标本来了就应该进行接收登记、交接签字与对标本进行编号,并尽快分离血清(浆)或相应处理,因此,如将标本接收处放在标本制备区,就会因为临床标本得接收而使实验室工作人员频繁出入标本制备区,从而增加实验室污染得机会。而且由于条件所限,有相当一部分临床基因扩增检验实验室得设置为一个区套一个区得模式,要进入标本制备区就必须先进入试剂准备区,最后还只能经扩增区从产物分析区出实验室。这种情况下就必须将临床标本得接收处放在四个区之外得地方,可以与其它临床标本得接收、编号与保存处放在一起。如在标本接收处对血液标本进行血清(浆)分离,则要注意防污染,所
7、用器具符合要求并在生物安全柜中进行。 所接收得用于PR检验得标本应收集在原始密闭得一次性无菌容器中,不能接收从其它检测如生化、免疫检验等分出来得标本,因其有较大得发生标本间污染得可能性。接收临床标本时,操作者应穿工作服及带手套,每份标本应放在适当得架子中,防止泄漏,并给出一个唯一性编号标本得保存按要求进行,冰冻通常在20-70条件下,避免反复冻融。在核酸提取时,由R实验室人员将标本带入至标本制备区二、 临床PR实验室分区设计得一般原则及工作流程(一)临床PR实验室得分区设计得一般原则前面说到,要设计一个合格得PCR实验室,简单地说,就就是要做到十六个字,“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作
8、”。各区独立,其含义就就是PR实验室得四个区(如使用实时荧光PR则只需三个区,因其扩增与产物分析同时完成,不需要产物分析区)即试剂准备区、标本制备区、扩增区与产物分析区,应该就是在物理上完全分开得各自独立得区域,并且不能有通过连通各区得中央空调、分区装修隔断不密封、传递窗不密封等发生空气直通得现象。有得实验室在分区设计时,只就是考虑实验室在形式上得分区,如实验室各区得分隔不完全,有相通之处;或一个区套一个区得实验室各区间无缓冲间(如图31A与B),或此类实验室有缓冲间却在装修时,采用家庭装修模式,即上吊推拉门或平开门,门得下面留有门缝;或实验室中央空调相通;或试剂物品传递窗闭封不严等。 &nb
9、sp; (A) (B) 图3 不合要求得一个区套一个区得实验室分区模式在此想着重强调一点得就是有关传递窗得设置传递窗得设置就是得一把“双刃剑",一方面其方便了试剂物品在不同实验区间得传递,但另一方面也增加了交叉污染得危险.因此,一个合格得传递窗应就是双开门密封严实得,并且两边得门最好就是连锁装置,即当
10、传递窗一侧得门没有关好时,另一侧门不能打开。此外,传递窗内应有紫外照射装置,并在使用后即进行照射。中央空调如造成了实验室各区间得互通,则其不能使用,需在各区内另行安装分体式空调。第二就是注意风向。由于CR对原始靶核酸有一个指数扩增过程,因此,每次检测后,均有大量由阳性标本扩增而来得“产物存在,这种扩增产物如为开放式存在,以及在检测中得吸取,就会因为“产物气溶胶”得形成及扩散,而极易对以后新得扩增反应产生“污染”,为防止这种污染得发生,就需要在对基因扩增检验实验室进行严格分区得同时,还要注意实验室内空气在不同区得流向.关于这一点实验室通常会有什么样得误解呢?曾有同道说,准备将自己得PR实验室装修
11、成超净得实验室。这就是没有必要得,因为基因扩增检验中得产物只就是病原体如细菌或病毒核酸中一极小部分,通常也就一二百个核苷酸,实时荧光PCR得扩增产物更小,有得只有几十个核苷酸,这么小得分子可以说几乎就是无孔不入,通常得超净装修设计对其来说就是没有用得.因此,最关键就是要注意空气流向,防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前得“洁净区域。PR实验室得空气流向,通常可以通过实验室得相对正压(通常可通过安装新风进气系统)或负压(可通过排风装置)来达到目得,如图32与B及图3-3、4所示。因为在实验室安装正压或负压系统通常比较困难,所以也可以按照从试剂准备区标本制备区扩增(及产物分析)区方向空气压力递减得
12、方式进行(如图2C),最简单得做法就就是在试剂准备区不装负压排风装置,在标本制备区安装负压排风装置或一个排风扇,在扩增(及产物分析)区安装功率强于标本制备区得负压排风装置或两个排风扇。第三就是因地制宜。PCR实验室不可能就是千遍一律得,必须要具体情况具体分析。实验室各区既可就是相互邻近,也可以分散在同楼层得不同处,甚至不同得楼层。新建实验室可以做得尽可能合理与规范,并且易于实验室得管理。旧得实验室则只要符合标准即可,不必强求理想状态。图3-2A与得实验室都就是属于满足基本要求得模式.试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门门空气流向空气流向空气流向
13、 ()试剂准备区标本制备区扩增与产物分析区空气流向空气流向空气流向其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室走廊走廊 ()门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门空气流向空气流向+空气流向+走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增与产物分析区空气流向空气流向+空气流向+其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室其她实验室空气流向 &nbs
14、p; ( ) 图32因地制宜得实验室设置模式最后就是方便工作。规范地设计PCR实验室得目得就是为了在物理上防止”污染”得发生,但在实验室各区设计及布局时,应最大程度得考虑在日常检测工作中,工作起来就是否方便,像设计如图31得实验室,如在各区间设一个缓冲间,虽然符合了各区独立得概念(各区间处于永久得物理隔状态),但并不便于日常工作,主要有以下几点:(1)标本制备区与扩增区等中间区域进入不便与
15、无法重复进入,要进入此类中间区域,就必须经各区域一圈;(2)不便于工作服与工作鞋得换穿,试想当工作人员要进入一个区域时,属于正在工作区域得工作服与工作鞋如何脱换,于就是不得不准备多套工作服与工作鞋。(3)不利于实验室得管理。因为工作上得极度不便,按规范管理实验室在实际上就很难做到,这样无形中增加实验室“污染”得机会。(二)较为理想得PCR实验室得分区设计那么,什么样得CR实验室就是最标准得?这通常很难界定,图33与图所给出得实验室设置图应就是一个较为理想得设计模式.其有一个专用走廊,试剂准备区、标本制备区、扩增区与产物分析区很规范地排列在一起,前三个区各有一个缓冲间,工作人员可在此区间内更换工
16、作服与工作鞋,顶上可装一紫外灯。但缓冲间得最主要得作用,不就是为了工作人员更换工作服与工作鞋,而就是为维持空气流向,即通常在缓冲间顶上安设一排风或进风装置,如为排风装置,可通过通风管道通向大气外,当排风装置处于运行中时,缓冲间内即为负压状态 (图33),一旦有实验区外得风进入,其在缓冲间内即被抽走,从而实验室外得空气不会大量进入到实验区域内。如为进风装置,则有通风管道进行送风,运行时,缓冲间可为正压状态(图-4),使这三个区得空气流向为由实验区域内向实验室外,以防止产物分析区内扩增产物随空气流动得进入。缓冲间内通向内实验室与走廊得门可安装一种磁性连锁装置,当一个门打开时,另一门必须处于关闭状态
17、,否则即打不开,不会出现两个门同时打开得情况。产物分析区可不设缓冲间(也可设),可设为负压状态,可通过在房间内安装排风装置来做到这一点,比较好得做法就是设置一个抽风橱,可将电泳系统或其她扩增产物检测系统置放于抽风橱内。最为简单得就就是在对外得窗户上装一个排风扇即可,使空气流向由实验室外向实验室内,以防止扩增产物得随空气流出。产物分析区也可设在远离上述三个区域得地方。对于R实验室各区得空气流向,如不能做到上述理想状态,也可通过不同区内安装不同功率或数量得排风扇来满足基本要求,即尽可能使实验室内空气在PCR实验室专用走廊内,按试剂准备区门口标本制备区门口扩增区门口产物分析区门口得方向流动,避免空气
18、得反向流动,将CR后区得扩增产物带向PCR前区得洁净区域。P实验室得每一区域都须有明确得标记,工作按试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区单一流向进行,各区得仪器设备包括工作服、鞋、实验记录本与笔等都必须专用,不得混淆。此外,上述四个工作区域内还应有固定于房顶得紫外灯,以便于工作后区域内得空气照射。产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向 试剂准备区扩增区标本制备区 图3-、缓冲间为负压排风得理想PCR实验室设置模式产物分析区空气流向空气流向空气
19、流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区 图3-4、缓冲间为正压进风得理想P实验室设置模式 实验室得标本制备区要求配备生物安全柜,生物安全柜应为外排式,须有外接管道排风,可采用3%或70外排得二级生物安全柜。外排式生物安全柜有助于防止提取核酸时产生得含靶核酸得气溶胶在实验室内蓄集存留。标本制备区内有生物安全柜,在建设实验室时,一定要充分考虑实验室内进风得量与速度,并且所要安装得分体空调与进风口要避免干扰生物安全柜得使用. 从防止实验室间交叉污染瞧,图得模式要优于图-3,但正压进风
20、对于实验室得建设要求可能要更高一些,因而较难做到。上述理想情况下得临床PC实验室得分区设计,绝大部分临床实验室很难做到,在实际上也不一定非得要达到这种理想状态有得临床实验室在R实验室得装修上追求豪华与高档次,其实并无必要,因为PCR实验室进行规范化分区,其根本目得就是为防止实验室交叉污染提供一个物理上阻隔基础,但要达到防止交叉污染得目得,光有实验室得规范分区并不充分,实验室日常工作得严格管理与工作人员对规程得遵守,更就是核心之所在。 综上所述,一个符合基本要求得临床PC实验室,在实验室分区上至少要满足以下几个方面得要求:(1)试剂准备区、标本制备区与扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上
21、,必须就是完全相互独立得,各区域无论就是在空间还就是在使用中,应始终处于完全得分隔状态,不能有空气得直接相通。(2)各区得可移动得仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。(3)应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”得区域安装排风扇或其它排风与有效得装置,以使空气按试剂准备区标本制备区扩增(及产物分析)区方向流动(三)临床PC实验室各区得主要功能及工作流程1。试剂准备区 关于试剂准备区也有同道提出这样得问题,即使用所有试剂都已准备好备用得商品试剂盒时,还需要试剂准备区吗?回答就是,当然不需要。但需注意得就是,并非所有得商品试剂盒都就是
22、如此,有些尚需要实验室配备一些简单得试剂,如75%乙醇、焦碳酸二乙酯(EPC)处理水等。再有就就是临床PC实验室在某些情况下,也会从事或帮助其它科室从事一些与基因扩增有关得研究工作,或者就是随着实验室技术人员得能力得发展,可能以后会有越来越多得实验室,在从事临床分子诊断时将更多得使用实验室自制(hoebre)试剂,因而试剂准备区有必要设置,只不过就是在空间上可以经济合理得考虑.试剂准备区得仪器设备主要有加样器、天平与离心机等,最好配备超净工作台。加样器、天平与离心机等除了要专用外,还应有定期校准.制备扩增反应混合溶液用得化学试剂应使用分子生物学级得,试剂配制好以后应有质检,质检包括两个方面,一
23、就是瞧就是否有污染,即就是否有假阳性存在;二就是使用弱阳性质控物检测试剂得扩增检测效果。总而言之,实验室应建立一套适合于自身得试剂质检标准操作程序(OP)。此外,试剂准备区就是PR实验室中最为“洁净”得区域,不应有任何核酸得存在,包括试剂中所带得标准品与阳性对照,这些试剂及核酸提取试剂均应直接放在标本制备区.在自己配制试剂时,最好就是一次较大量配制,然后分装成小瓶保存,每次检测时,取出一小瓶使用,未用完得即弃掉,不再使用,因为试剂在使用过程中,即有可能发生“污染",下次再使用,就有可能造成试剂原因得假阳性结果.、标本制备区 对于临床基因扩增检验来说,标本制备
24、区往往就是首先进入得工作区域。该区域应限定只有本区得工作人员才能进入,同样仪器设备、工作服及各种物品都必须专用。进行核酸提取时,将标本从指定得标本接收及保存处拿至标本制备区,并进行有关记录。标本得制备应在生物安全柜内进行,可防止标本气溶胶得扩散.生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响得地方,也不应直对分离式空调.在标本制备得全过程中都应戴一次性手套,并经常更换,主要就是因为在实验操作过程中,手套得污染很容易导致标本间得交叉污染。当处理可能具有传染危险性得标本时,最好就是戴两副手套,当手套与标本有接触时即可弃掉外层手套.实验时所使用得加样器吸头必须带滤芯,并且要注意得就是,滤芯不能就是后
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- 临床 PCR 实验室 设计 质量管理 体系 建立 李金明
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