中枢神经损伤修复与功能重建中胶质细胞的作用及意义.docx

项目名称：中枢神经损伤修复与功能重建中胶质细胞的作用及意义首席科学家：段树民 浙江大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部 浙江省科技厅二、预期目标本项目的总体目标： 围绕胶质细胞在神经损伤、再生修复与功能重建中的作用这一关键问题，从分子、细胞、环路、功能多层次开展研究，揭示神经元存活、神经发生、轴突再生、环路重建等神经再生与修复关键环节的机制，阐明胶质环境的作用和调控规律， 明确神经元胶质细胞血管单元的协同作用机制，寻求治疗神经损伤、促进修复与功能重建的新策略。为理解神经与胶质细胞相互作用提供新的理论基础，并为临床治疗神经损伤提供前瞻性思路。五年预期目标: 1）深入认识神经损伤诱导的胶质反应的分子机制，明确胶质细胞溶酶体胞吐机制及其在神经损伤修复中的作用，鉴定出特异胶质细胞分泌的23种新分子并明确其功能。2）明确zlingo-1、Celsr3等分子在轴突代偿、再生、导向和髓鞘再建中的作用的机制，揭示脊髓运动神经元的轴突再生机制及胶质细胞和介导细胞的作用，鉴定23种源自少突胶质细胞能够促进轴突再生与髓鞘修复的新调控因子。3）深入认识胶质细胞细胞周期调控、胶质细胞代谢活动和MicroRNAs在神经保护和损伤修复中的作用，阐明组胺对胶质细胞活化与功能的调节机制。明确23种针对胶质细胞作用、促进神经保护与修复的新标靶。4）深入认识nNOS亚细胞定位对神经元命运的影响，明确放射状胶质细胞在神经发生中的作用，揭示神经损伤引起的内环境变化影响神经干细胞定向分化及存活的机制，力争建立将损伤区增生的星型胶质细胞重编程分化为神经元技术体系。5）阐明损伤后新建立的功能区血管神经单元结构与功能改变的有效性证据与分子机制；明确脊髓损伤后神经根移位改善其介导的生物学效应的机制。建立多模式影像学等技术，并运用于活体实时检测神经修复过程。力争建立通过干预受损神经环路，实现神经回路桥接和功能重建的技术。6）取得一批具有重要国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物（影响因子5以上）发表高水平论文40篇以上。7）力争获得具有临床应用前景的研究结果，获得10项以上国家发明专利，为研制治疗神经损伤的新药创造条件。力争有1-2个创新药物展开临床前研究。8) 力争培养若干名长江学者、国家杰出青年等优秀青年学者、培养一批优秀的博士与硕士研究生。打造一支具有国际竞争力研究队伍。9）建立国际先进的神经损伤修复与功能重建基础研究平台。三、研究方案学术思路与技术途径 中枢神经损伤修复是当今神经科学最重要的研究领域之一，也是难点之一。目前的工作主要集中在对神经元本身的研究，虽然取得较大进展，但对一些关键环节的了解仍然有限。由于相关基础研究的局限，限制了临床治疗手段，迫切需要从新的角度探索并实现突破，从而为寻找新的治疗策略提供基础。国内外越来越多的证据提示，中枢神经系统的损伤，不仅仅仅涉及神经元，还有胶质细胞、血管等细胞与组织。因此神经的修复与功能重建必须运用整体的观念系统考虑胶质细胞反应、血管新生和功能调制等综合因素。损伤后神经元的存活、新生、再生、环路重建主要取决于局部微环境环境改变。因此，神经元胶质细胞血管单元的协调、共生是有效修复与功能重建的基础。为此，本项目设立了紧密联系又各有侧重的五个课题组：1、神经损伤中胶质细胞作用及调控机制：主要研究神经损伤修复过程中胶质细胞的反应和胶质细胞对神经元作用的分子机制，着重探索神经元胶质细胞相互作用的基础。2、轴突再生与髓鞘修复：聚焦神经再生的最关键环节轴突再生，探讨影响轴突生长的内在与外在因素，并综合考量少突胶质细胞与嗅鞘细胞在髓鞘修复中作用的分子机制。3、神经保护干预的新标靶研究：主要针对神经损伤后的第一要务，即保护神经促进存活。重点研究胶质细胞和神经元特异分子标靶，设计既能针对性（胶质细胞出现的问题）地保护，又最大限度地避免（对神经元的）非特异的副作用。4、神经干细胞分化与神经损伤后的环路重建： 主要研究神经细胞分化、存活、迁移及与局部环路整合，克服神经干细胞治疗的瓶颈，并探索将损伤导致的胶质疤痕细胞转化成神经元的可能性。5、神经损伤后功能重建及其结构基础：，关注神经元胶质细胞血管单元的协调、共生作用，并运用光感基因技术调控特定神经元或胶质细胞活动再建功能环路。建立多模式影像学技术、神经元集群活动分析技术，实时检测神经损伤修复过程。研究方案从关注损伤修复过程中神经元胶质细胞相互作用的前沿科学问题（课题一、课题二）出发，向保护神经元、促进再生修复的应用基础研究（课题三、课题四）过渡，并探索功能重建的有效方案和实际应用的可能性（课题五）。从而实现多层次、多角度、递进性、综合性地研究神经损伤修复与功能重建基础的技术路线。 创新点与特色 神经元的再生修复与功能重建，有赖于包围神经元的胶质细胞环境的改善。鉴于以下事实：1、神经生长依赖胶质细胞产生的营养与支持物质；2、目前发现的抑制神经元突起生长、髓鞘再生的内源性分子也多是胶质细胞所产生；3、神经损伤后释放的引起继发损伤的多种有害分子需要胶质细胞清除。 我们有理由认为，神经元生长环境的改善，即各种胶质细胞特性和功能的改善是调控CNS损伤后的神经再生和修复的关键因素。为此，我们将围绕胶质细胞在神经损伤、再生修复与功能重建中的作用这一主题开展研究。这是本项目学术思路的核心，体现了本项目的重要创新和鲜明特色。神经的再生与功能重建是系统工程，单纯着眼于神经元的修复，在临床治疗取得成功的可能性微乎其微。目前神经再生修复进展缓慢也充分说明了这一点。为此，本项目强神经再生的微环境因素和“系统协调”的学术思路：1、不仅重视轴突的再生，而且重视髓鞘的重建；2、不仅针对神经元，而且重点针对胶质细胞干预促进神经保护；3、不仅考虑神经元环路重塑，而是将神经元-胶质细胞血管单元作为整体来实现神经修复与功能重建。因此，“系统、协调、共生”的整体观念是本项目研究的重要特色。强化源头创新，是本项目的又一重要特点。胶质细胞分泌、迁移不仅是胶质细胞重要的基础科学问题，而且是影响神经再生修复的关键因素，本项目在这一领域有突出优势，将有力促进神经再生、修复与功能重建研究。另外，我们将针对在神经再生中有特异促进作用的嗅鞘细胞，筛选鉴定促进神经再生的新蛋白；针对在髓鞘再生中起关键作用的少突胶质细胞，筛选鉴定促进髓鞘重建的关键分子；针对在损伤反应中起重要作用的星胶质细胞和小胶质细胞，筛选鉴定新的调控因子。这些从源头入手的探索，有可能成为本项目的创新亮点。新技术的运用、建立对于推动神经再生、修复与功能重建研究的深入发展，具有重要作用。本项目不仅运用传统的基因表达与沉默技术，而且建立、发展选择性调控胶质细胞特定分子的技术方法；不仅运用光感基因技术调控特定神经元活动，而且将其用于调控特定胶质细胞活动；另外，我们将利用学科交叉优势，建立多模式影像学技术、神经元集群活动分析技术，并运用于活体实时检测神经损伤修复过程。这些新技术的运用、建立不仅体现了技术方法的集成创新，而且将有力推动神经再生、修复与功能重建研究的进步。可行性分析 本项目是在项目组成员主要研究工作的基础上，经过分析该领域国内外研究现状后提出的。项目组成员在胶质细胞在神经再生修复与功能重建中的作用这一研究领域，有较好的工作与知识积累。段树民实验室发现，星形胶质细胞溶酶体具有分泌功能，释放大量的ATP 和溶酶体水解酶可能会加重神经损伤（Zhang et al. Nature Cell Biol 2007B）；胶质细胞对突触活动的调制（Yang et al. PNAS 2003; Zhang et al. Neuron 2003; Ge et al. Science 2006）。吴武田实验室发现，敲除或抑制少突胶质细胞的LINGO-1，可促进神经损伤后髓鞘再生和轴突功能的恢复（Mi et al. Nature Medicine 2007）。周立兵等发现遗传性皮质脊髓束剥夺，并未影响小鼠的肢体运动功能（Zhou et al. Science 2008）。何成实验室发现嗅鞘细胞基因修饰，使其高表达胶质细胞营养因子后移植到损伤脊髓，能够显著改善脊髓损伤后的功能修复（Cao et al. Brain 2004）。王伟实验室提出神经元与胶质细胞的细胞周期以及调控机制存在本质差异，通过调控细胞周期，可达到抑制神经元凋亡及胶质细胞过度活化增殖的双重疗效（Wang et al. Prog Neurobiol 2009）。朱东亚等发现脑损伤后CREB激活诱导神经发生（Zhu et al. Proc Natl Acad Sci USA 2004）。杨国源在国际上首创小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，并对脑损伤机制进行了深入系统研究。本项目的一些研究内容是原有研究延续与深入，具有扎实的基础，有较强的可行性。本项目的研究队伍由来自国家985高校的浙江大学医学部、北京大学医学部、上海交通大学、复旦大学、中国科学技术大学和211工程大学的第二、第四军医大学、华中科技大学同济医学院、南京医科大学、暨南大学医学院以及实力雄厚的中国科学院上海药物所、北京生物物理所的研究骨干组成。依托于卫生部医学神经生物学重点实验室、卫生部神经生物学重点实验室、教育部神经系统重大疾病重点实验室、教育部分子神经生物学重点实验室、国家新药研究重点实验室等国家与省部级研究基地。技术平台先进、全面，仪器设备齐全。 参与本项目成员主要为来自研究一线的从事神经损伤、修复与功能重建和胶质细胞功能的学者，具有丰富的科研经验；团队拥有中国科学院院士一名、长江特聘教授三名、国家杰出青年基金获得者五名、中科院百人计划四名以及许多优秀的中青年学术骨干。不仅有基础生物医学研究工作者，而且有临床医生，还要从事信息研究和药物研究的学者，形成了一支综合交叉、特色鲜明的研究队伍。基于上述因素综合考量，我们认为，本项目具备了取得重大突破的可行性。课题设置:课题一：神经损伤中胶质细胞作用及调控机制主要研究内容:要解决的关键问题和课题思路：普遍认为神经损伤引起的星形胶质细胞和小胶质细胞激活（包括细胞形态改变，某些分子的表达水平，细胞分泌、运动和吞噬活动等功能的变化）是影响神经损伤和修复的关键因素，但引起胶质细胞激活的机理、本质和意义并没有得到深入研究，制约了从干预胶质细胞激活的角度来开发治疗神经损伤的手段。本课题组织了对胶质细胞基础研究有良好背景的研究团队，将从分子细胞水平深入研究神经损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的反应、功能和特性变化及其分子机制。通过分析比较不同胶质细胞分泌组分，鉴定出具有促进神经修复的新分子，从而深入揭示胶质细胞反应和变化对神经损伤修复的影响。该课题的研究成果将为其它几个课题提供基础。预期目标:阐明诱导小胶质细胞和星形胶质细胞胞饮、和溶酶体胞吐的信号转导机制及其在神经损伤修复中的作用。明确星形胶质细胞受到损伤刺激后发生增殖的信号机理和反向分化特征，找出它们与神经前体细胞不同的分化命运决定信号系统。鉴定出特异胶质细胞分泌的23种新分子并明确其对神经再生和生长的功能。申请国家专利1-3项，在有重要国际影响的杂志发表8-12篇研究论文。承担单位：浙江大学、北京大学、第二军医大学课题负责人：段树民学术骨干：于常海，何成，向正华，沈颖预算经费：28% 课题二：轴突再生与髓鞘修复主要研究内容:要解决的关键问题和课题思路：中枢神经损伤后修复和功能重建的主要障碍除了神经元难以再生以替代损伤死亡的神经元外，另一个关键环节就是损伤的轴突难以再生和再髓鞘化，不能生长和导向到正确靶细胞形成功能性联系。后一矛盾在脊髓外伤中尤为突出：受损脊髓累及了上下传导的神经轴突，虽然损伤脊髓断面上、下的中枢神经元仍然存在，但由于它们上下行的轴突受损后难以生长并穿过受损区到达靶细胞，致使其功能丧失，导致运动和感觉障碍。针对这一突出问题，我们设置本课题，组织了在脊髓和视神经损伤研究领域有着良好基础的研究团队，利用多种具有不同特色和优势的神经损伤动物模型（包括经典的脊髓损伤动物模型、遗传性皮质脊髓束剥夺动物模型以及斑马鱼视神经损伤模型），深入研究神经元轴突再生和生长导向、少突胶质细胞与神经元相互作用机制及其对髓鞘再建的影响，神经环路重塑和功能代偿基础等具体分子细胞机制，探索改善轴突生长微环境、促进神经损伤的修复和功能重建的机理和新策略。预期目标:阐明zlingo-1、Celsr3等分子及介导细胞在轴突、再生、导向和髓鞘再建中的作用及机制，揭示神经通路代偿中神经元环路和胶质细胞网络重塑机制，明确脊髓运动神经元的轴突再生过程中星形胶质细胞的作用及其机制，鉴定23种源自少突胶质细胞能够促进轴突再生与髓鞘修复的新调控因子。为临床先导化合物的初筛和作用机制的研究提供平台。在有重要国际影响杂志发表7-10篇研究论文。承担单位：暨南大学、中国科技大学、第四军医大学课题负责人：吴武田学术骨干：胡兵，周立兵，游思维预算经费：19%课题三：神经保护干预的新标靶研究主要研究内容:要解决的关键问题和课题思路：神经损伤后的首要任务是保护神经元，减少神经损伤，这在脑中风等以神经细胞死亡为特征的神经损伤疾病中尤为重要。过去有关神经保护的研究，多从神经元本身的角度考虑，所得到的研究结果也多不能区分是对神经元的作用还是对胶质细胞的作用。本课题组织了在临床神经疾病、神经药理和研发等领域有很好研究背景的团队，从神经元生存的胶质细胞环境这一角度出发，研究胶质细胞重要特性和特殊功能及其在神经损伤后的变化及意义，探讨通过干预神经损伤后胶质细胞功能而达到改善神经元生存环境、促进神经元存活和神经修复的目的，为寻找神经保护靶点提供新的思路和依据。预期目标: 明确神经损伤修复过程中神经元和胶质细胞细胞周期不同调控机制、确定胶质细胞特异代谢活动和MicroRNAs对神经损伤修复中的影响，阐明组胺对胶质细胞活化与功能的调节机制。明确23种针对胶质细胞作用、促进神经保护与修复的新标靶。申报3-5项国家专利，在有重要国际影响杂志发表6-9篇论文。承担单位：华中科技大学、浙江大学，中国科学院药物研究所课题负责人：王伟学术骨干：陈忠，镇学初，连晓媛预算经费：20%课题四：神经干细胞分化及其与神经环路的整合主要研究内容:要解决的关键问题和课题思路：由于干细胞移植所具有的来源、伦理、成瘤和免疫排斥等问题限制了其在临床的应用，如何改善内环境，促进内源性神经干细胞的增殖分化、存活及其与神经环路的整合可能具有更重要的意义。神经损伤产生的炎症反应、神经元过度兴奋及胶质细胞激活等病理性内环境可能是决定神经干细胞增殖分化及新生神经元存活的关键因素。鉴于此，本课题组织了在神经损伤和干细胞研究领域有良好工作基础的研究团队，重点研究内源性神经干细胞特性及其与成熟神经元和胶质细胞的相互作用，研究神经损伤时所产生的内环境变化对神经干细胞定向分化及存活的调控机制，探讨利用基因操作技术将损伤区增生的星型胶质细胞重编程分化为神经元的可能性。通过这些研究寻找促进损伤组织中新生神经元存活及其与局部神经环路整合并发挥功能代偿的有效途径。预期目标: 深入认识nNOS在不同神经细胞的亚细胞定位对神经元命运的影响，明确神经损伤修复过程中放射状胶质细胞特性转化的意义，揭示神经损伤引起的内环境变化影响神经干细胞定向分化及存活的机制，力争在损伤区增生的星型胶质细胞重编程分化为神经元方面有重大突破。申报国家专利2-4项，在有重要国际杂志发表论文7-10篇。承担单位：南京医科大学，复旦大学，华中科技大学，浙江大学课题负责人：朱东亚学术骨干： 杨振纲，刘修鑫，郑铭豪预算经费：14%课题五：神经损伤后功能重建及其结构基础主要研究内容:要解决的关键问题和课题思路：CNS损伤后的修复与功能重建是复杂和艰巨的挑战，必须进行多方面的探索，尽可能应用多学科的综合手段。损伤区（如缺血半暗带，损伤区域周围水肿带）是治疗的主要靶点，损伤区发生和发展可能与兴奋性氨基酸介导的Ca2+超载、中性粒细胞聚集导致微血管阻塞、梗死周围组织细胞去极化和细胞凋亡有关。但已有的证据中并不能找到充分支持脑损伤发病机理的证据。神经血管单元损伤概念的提出，以及对其整体结构和相关功能进行深入研究，是目前影像学，特别是分子影像学研究的热点之一，通过激光共聚焦显微镜、扫描电镜、磁共振、Micro-CT、PET/CT技术，不仅可提供准确的解剖学的信息，还可通过化学位移成像，在损伤超急性期和急性期检测到分子的改变。扩散张量成像(DTI)技术则可通过平均扩散系数和部分各向异性(fractional anisotropy)等参数显示损伤中心区细胞细微结构的破坏程度。应用多模式影像技术，可以在活体内对靶向生物大分子和生物进程进行定量的、可重复的成像，动态了解细胞和分子水平的变化。运用光感基因神经调控技术,可以实现对特定类型神经元的控制。结合光感基因神经调控技术和神经集群记录等工程技术，在整体水平研究特定神经环路中目标神经元的活动模式，建立相应的“刺激-响应”模型，研究神经环路在神经损伤和修复过程中的作用机制，通过对受损神经环路的干预，实现神经回路的桥接和功能重建。本课题组织了具有不同学科背景和特色的研究队伍（包括医学基础、临床医学、影像检测、脑-机接口和信息工程各领域的专家），利用学科交叉优势、先进的功能检测技术和独特的研究手段，探讨CNS损伤后神经环路重建和功能代偿的结构基础，从多个角度寻找新的突破点。同时，该课题组成员将在组内及与其他课题组之间密切合作，相互支持，作为该项目协作交流的平台。课题组长是从事脑缺血损伤基础研究的资深科学家，近年来尤其对交叉医学科学和技术感兴趣，目前任交通大学交叉医学（ Med-X）研究院副院长，有交叉学科协作研究经验。预期目标: 明确损伤后新建立的功能区血管神经单元结构与功能改变的有效性证据与分子机制；阐明脊髓损伤后神经根移位后中枢环路代偿特征和机制。应用多模式影像学等技术揭示神经损伤修复和功能重建的动态过程、分子机理和结构基础。力争建立通过干预受损神经环路，实现神经回路桥接和功能重建的新技术。申报国家专利2-5项，在有重要国际影响杂志发表论文6-10篇承担单位：上海交通大学，中科院生物物理研究所。浙江大学，第二军医大学课题负责人：杨国源学术骨干： 王晋辉，张宏，封洲燕，侯春林预算经费：19%课题间相互关系： 中枢神经损伤后功能能否重建取决于四个关键环节：神经轴突生长和重新髓鞘化、神经元存活、神经元的新生及其与神经环路的整合、以及神经环路的重建及功能代偿。围绕这四个关键环节，基于胶质细胞环境可能是调控成年CNS 损伤后修复的关键因素这一认识，我们组织了五个团队从不同角度深入研究CNS损伤修复过程中神经元和胶质细胞相互作用机制及其意义，探讨损伤修复和功能重建的基础，从新的角度寻找有效干预途径。这些团队既有不同研究背景和分工明确的课题，又有交叉协作，互补互助。课题一集中了胶质细胞基础研究专家，主要研究神经损伤修复过程中胶质细胞的反应和胶质细胞对神经元作用的分子机制，探索神经元和星形胶质和小胶质细胞相互作用的机制和意义，是神经损伤修复中有共性和普遍意义的研究。该组的研究成果为其他课题组提供基础支持。第二课题组集中了脊髓损伤和轴突生长及其导向研究领域的专家，关注神经再生的第一个环节即神经元轴突损伤后（脊髓损伤和视神经损伤的主要矛盾）神经纤维再生及其髓鞘再建，探讨影响轴突生长的内在与外在因素，并研究少突胶质细胞与神经元的相互作用及其对轴突生长和髓鞘再建的影响。第三课题组集中了神经疾病临床基础研究和神经药理研究专家，主要针对神经损伤修复的第二个关键环节，即保护神经元存活的问题（是脑外伤和脑卒中的主要矛盾），重点研究胶质细胞和神经元特异分子标靶，设计既能针对性（胶质细胞出现的问题）地干预，又最大限度地避免（对神经元的）非特异副作用的策略。第四课题组则集中了神经干细胞研究专家，针对神经损伤修复的第三个环节，即神经元的新生及其与神经环路的整合，研究神经损伤后内源性神经干细胞的增殖、分化、存活、迁移及与局部环路整合的分子机制，并探索将损伤导致的胶质疤痕细胞转化成神经元的可能性。力争克服神经损伤后神经干细胞难以产生足够有功能的神经元的瓶颈。神经损伤修复的第五个关键环节-神经环路重建和功能代偿，是一个复杂系统问题，为此我们在第五课题组集中了综合交叉领域专家，包括神经损伤基础研究专家、脊髓损伤治疗和研究的神经外科专家、多模式影像检测专家、以及神经信息编码和脑-机接口专家。我们期望不同领域专家在面对这一共同感兴趣的挑战性问题时，利用交叉优势、充分协作交流，碰撞出新的火花。该课题将应用先进的动态在体多模式影像功能检测技术结合分子生物学及微观分析手段，对神经元胶质细胞血管单元功能重建、脊神经移位嫁接后中枢环路重塑和神经功能代偿等复杂环路机制进行深入研究和综合动态分析，并运用光感基因技术调控特定神经元或胶质细胞活动、结合神经元集群活动分析技术，实时检测神经损伤修复过程，探讨促进神经环路再建和功能代偿的新途径。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1、研究损伤等刺激对小胶质细胞溶酶体胞吐的影响极其信号转导机制；研究诱导胶质细胞吞饮活动的信号机制。2、分析与鉴定星形胶质细胞、OECs等胶质细胞特异分泌蛋白，并检测这些蛋白在体外培养和体内胶质细胞中的表达情况。3、损伤前及损伤后各时程各种骨架蛋白 mRNA和蛋白的动态变化以及在用细胞激活过程中的相互作用关系。4、P2受体在中性粒细胞迁移和激活过程的可能作用:分离纯化中性粒细胞，用P2X和P2Y受体激动剂或/和拮抗剂，观察P2X和P2Y受体各亚型在中性粒细胞迁移中的可能作用及其可能信号传导机制。5研究以Celsr3表达为特征的介导细胞导向轴突生长基本的生物学特性。6、研究遗传性传导束剥夺动物模型的培育、鉴定、运动相关神经结构的代偿情况。7、鉴定斑马鱼zLINGO-1等因子的基因表达及时空图谱。8、绿色荧光蛋白嗅鞘细胞的分离、培养和纯化，制备过表达CNTF的转基因嗅鞘细胞；眼玻璃体腔内移植嗅鞘细胞对视神经损伤修复的作用。9、建立动物脊髓损伤模型，研究SCI后损伤区域的胶质神经血管病理变化以及行为学功能障碍。10、研究分别和同时促进磷酸戊糖旁路、抑制乳酸生成性糖酵解通路和促进三羧酸循环，对星形胶质细胞产生GSH和Gln以及摄取和处理Glu的影响及其作用机制。11、研究缺血早期和后期组胺能神经系统特征。12、分析神经损伤性疾病中神经胶质细胞的miRNAs表达变化；体外表达Gt-1细胞模型。13、建立小鼠和大鼠成年神经干细胞培养技术，以及诱导分化、谱系鉴定、存活、迁移等方法；建立成年神经干细胞与原代神经元及组织移植块共培养技术；建立成年神经干细胞在正常及损伤脑组织的移植及追踪标记技术。14、建立胚胎和出生后小鼠脑薄片标本制备、全细胞膜片钳技术和双光子单细胞刺激技术，以及建立损伤组织中新生神经元标记及电生理功能鉴定方法。15、优化Sp8条件敲除小鼠的培育条件及表型鉴定。16、研究神经干细胞核内的nNOS对自身生物学功能的调控作用及成体神经干细胞分化过程中nNOS的亚细胞移位。17、利用双光子显微细胞成像技术系统地分析生理和病理条件下不同类型神经元、胶质细胞和血管活动特征。18、探索磁纳米颗粒或分子影像探针标记EPC，建立脑损伤模型（如实验性脑缺血），并进行EPC移植。19、建立和确认小鼠iPS干细胞与ES干细胞系；建立和完善大鼠脑梗模型。20、建立动物模型，于术后1个月、3个月、及半年取膀胱体部组织，进行病理学变化、递质测定、受体测定及细胞内钙离子浓度测定。21、多种光敏感基因的病毒载体的制备，病毒载体在实验动物上的表达及功能检测，神经集群信息解析方法的建立。1、阐明小胶质溶酶体胞吐的分子机制及其病理生理意义；阐明诱导胶质细胞吞饮活动的受体亚型及其下游信号转导机制。2、鉴定出一批星形胶质细胞、OECs等胶质细胞的特异分泌蛋白。3、明确细胞骨架在星形胶质细胞激活过程中的作用。4、发现与中性粒细胞迁移和激活相关的P2受体，并尽可能阐明其相关机制。5、建立不同年龄脊神经根撕脱后周围神经再植模型，为后期分析脊髓运动神经元的再生奠定基础。6、明确介导细胞的出生的时间点、细胞类型以及Celsr3在维持介导细胞生物学特性的作用。7、阐明遗传性传导束剥夺后神经元的增生（包括神经元数目和轴突分支）代偿潜能。8、完成zLINGO-1在斑马鱼中时空表达模式分析；初步构建斑马鱼眼动和视动行为学装置和实验技术新手段。9、完成供移植之用转基因嗅鞘细胞的制备；完成眼玻璃体腔内移植嗅鞘细胞对视网膜神经节细胞存活、再生和突出形成促进作用的研究。10、系统研究脑缺血后胶质细胞活化及神经血管单元结构与耦合功能损伤特征，探讨二者之间的关系。11、明确脊髓损伤后胶质细胞活化与神经血管单元损伤的关系。12、寻找和发现安全有效的加强胶质细胞的神经保护功能的新途径和药物作用新靶标。13、阐明组胺在缺血后不同阶段中作用特征。14、明确神经胶质细胞中miRNA在神经损伤中/神经保护中表达特征和变化。15、取得转录因子SP8介导神经干细胞向损伤区迁移和向神经元分化的初步结果。16、取得成体神经干细胞核内nNOS决定了自身存活、向神经元分化及与其他神经元建立突触联系的关键结果。17、了解神经干细胞在何阶段其核内的nNOS移向细胞浆，或者从核内表达的亚型转变为胞浆表达的亚型，以及这种nNOS亚细胞定位的变化是否与神经元的表型有关。18、鉴定出神经损伤修复中血管-胶质细胞-不同神经元活动规律。19、能够用磁纳米颗粒或分子影像探针成功标记EPC，并在脑损伤模型中进行EPC的干预治疗。20、RT-PCR与免疫组织化学方法确认iPS干细胞与ES干细胞和畸胎瘤形成状况。21、阐明脊髓损伤后及神经移位后膀胱病理表现变化及介导膀胱逼尿肌收缩和舒张的相关神经递质和受体数量的变化。22、制备完成多种启动子的光感基因病毒载体，使其可以成功表达于在体实验动物，通过电生理等实验手段，完成对光敏基因在体表达的功能检测；完成动物在体多电极群集记录技术的建立，建立非线性、动态和协同的神经集群解码算法。第二年1、研究胶质细胞吞饮后胞内分选的特征和分子机制；诱导小胶质细胞迁移活动的调控机制。2、检测胶质细胞特异分泌蛋白在神经元发生、轴突生长、髓鞘化过程中的作用。3、细胞内吞过程动态观察记录，得到衡量内吞的标准参数；内吞分子机制的研究；研究内吞相关信号分子与细胞骨架蛋白的相互作用。4、应用中性粒细胞迁移和激活相关的P2受体拮抗剂，观察其在治疗神经损伤修复中的作用；P2X1受体介导小胶质细胞激活和凋亡机制的研究。5、研究神经元与星形胶质细胞之间的相互作用对GLT1的调节作用；研究GLT1表达的改变对于神经元回路的影响。6、建立脊髓根性撕脱周围神经根再植的动物模型比较分析运动神经元轴突的再生能力。7、应用神经轴突追踪、激光共聚焦、电镜等技术研究以Celsr3为“桥梁”的介导细胞和神经轴突之间的作用模型。8、对比分析遗传性传导束剥夺后的动物模型胶质细胞及相关基因的表达的变化。9、利用“功能缺失”和“功能获得”的方法来明晰zLINGO-1是否参与调节胚胎发育和成鱼视神经修复过程中的髓鞘形成及再生。10、转基因嗅鞘细胞移植联合应用聚乙二醇和软骨素酶ABC的研究。11、初步研究特异性胶质细胞功能及细胞周期调控对脑缺血后神经损伤与修复的影响。12、研究胶质细胞双孔K通道与脑缺血过程中胶质细胞功能及神经元损伤的关系。13、研究分别和同时促进磷酸戊糖旁路、抑制乳酸生成性糖酵解通路和促进三羧酸循环，对胶质细胞功能紊乱的纠正作用和伴随的脑微环境重建。14、研究组胺作为内源性因子参与缺血性神经损伤中的保护作用。15、了解神经胶质细胞中miRNA在神经损伤中的神经保护作用；体外筛选新型Gly-T1抑制剂。16、构建携带TetOP-Ascl1- PEG-prom-p53慢病毒，以及携带Brn2和Myt1l的慢病毒载体。17、构建CREB负显性突变和结构性激活的慢病毒载体、端粒酶TERT过表达及RNA干扰的病毒载体、携带nNOS的PDZ结构域（氨基端1-133）基因的慢病毒载体。18、制备特异阻断nNOS-PSD95偶联的多肽和小分子化合物。19、系统研究放射状胶质细胞的生物物理学特性。20、初步研究体外诱导星型胶质细胞重编程的条件。21、研究Wnt3和Wnt5与血管-神经-胶质单元在神经损伤中的作用。22、应用分子生物学、免疫组化和多模式分子影像技术，检测是否EPC移植增加血管新生、改善血供和血脑屏障。23、小鼠iPS干细胞和ES干细胞分化研究；实施iPS干细胞和ES干细胞tk与fluc双基因转染标记。24、检测脊髓背根神经节、盆神经节及胸10节段内相关递质的分布及含量变化，以及阳性神经元的分布、数目及面积的变化情况。25、光感基因神经调控技术的建立，及其与多电极群集记录技术的结合，神经元编码解析计算模型的建立。1、阐明胞饮后胞内分选过程及其调控机制；发现小胶质细胞迁移活动调控新的信号通路。2、明确胶质细胞在新生神经元发生、轴突再生、髓鞘化过程中的作用。3、明确内吞类型；内吞与细胞肥大的相关关系；内吞信号转导通路；内吞相关信号分子与细胞骨架蛋白的作用关系。4、神经损伤过程中应用与中性粒细胞迁移和激活相关的P2受体的拮抗剂可减轻继发性神经损伤。5、明确Rheb/mTOR调节GLT1表达后在OGD和神经回路中作用。6、阐明周围神经的再植对脊髓运动神经元轴突再生能力的影响及机制。7、初步明确Celsr3和介导细胞导向轴突生长的生理机制。8、明确胶质细胞与神经元代偿性增生间的关系，及参与轴突再生代偿过程密切相关的靶基因。9、完成zLINGO-1在斑马鱼上“功能缺失”和“功能获得”的实验；电镜分析成年斑马鱼视神经损伤后再生过程中再髓鞘率的动态变化情况。构建斑马鱼眼动和视动行为学装置和实验技术新手段。10、完成视神经损伤局部应用聚乙二醇修复视神经损伤后变性的实验；完善视神经损伤区联合应用嗅鞘细胞、聚乙二醇和软骨素酶ABC的手术，并发现再生轴突沿损伤视神经生长。11、明确选择性调控胶质细胞活化增殖对胶质细胞功能、轴突再生微环境及神经血管单元损伤与修复的影响。12、寻找和发现安全有效的纠正胶质细胞功能紊乱和伴随的脑微环境破坏的新途径和药物作用新靶标。 13、阐明内源性因子组胺保护缺血性神经损伤中的作用机制。14、明确miRNAs表达后对损伤及保护中的作用；发现1-2个高选择活性化合物。15、制备出各种特异性干预靶分子的工具。16、完成成体神经干细胞核内nNOS决定了自身存活、向神经元分化及与其他神经元建立突触联系的研究。17、取得核内nNOS决定神经干细胞命运的分子机制研究的关键结果。18、取得放射状胶质细胞的生物物理学特性研究的初步结果。阐明调控其向神经元分化的分子机制。19、获得体外诱导星型胶质细胞重编程的基本条件。20、阐明胶质细胞中Wnt3和Wnt5在调节血管-神经-胶质单元参与神经损伤中的作用。21、证实EPC移植能增加血管新生、改善血供和血脑屏障，从而促进神经-血管功能单元的修复。22、建立tk与fluc双基因转染标记小鼠iPS干细胞和ES干细胞。23、初步证实正常神经根移位后膀胱低级排尿中枢（脊髓节段）出现了上移。24、完成动物在自由活动状态下的“光感基因-神经调控技术”的建立；在结合两种技术的基础上，实现光刺激-多电极记录的在体刺激和记录模式。在此基础上，建立相应的“刺激-响应”模型和神经元编码解析计算模型。第三年1、研究胶质细胞吞饮及分选活动在免疫抗原加工提成中的作用。深入研究小胶质细胞迁移活动信号转导、调控及其意义。2、深入分析胶质细胞特异分泌蛋白在神经元发生、轴突生长、髓鞘化过程中的作用机制。3、深入分析胶质细胞特异分泌蛋白在神经元发生、轴突生长、髓鞘化过程中的作用机制。4、显微缩时摄像术观察激活过程中细胞增殖现象（非对称分裂）。5、探索激活的星形胶质细胞转化为神经干细胞的可能途径。6、P2X1受体在小胶质细胞激活/凋亡过程中可能的信号传导机制；P2X1特异性拮抗剂局部用药或全身给药对神经损伤局部小胶质细胞、神经元的影响。7、研究脑脊索切断损伤时Rheb/mTOR通路对于星型胶质细胞GLT1表达的作用及其对损伤的作用。8、应用周围神经再植的模型研究胶质细胞的变化及其作用以及雪旺氏细胞的移植对运动神经元轴突再生能力的影响。9、分析Celsr3和介导细胞导向轴突生长的窗口期。10、在遗传性皮质脊髓束剥夺的小鼠进一步建立红核脊髓束剥夺的动物模型。11、比较斑马鱼视神经再生过程中各种胶质细胞反应模式与哺乳类反应模式的区别。12、研究含嗅鞘细胞周围神经桥对视神经再生的影响。13、研究选择性调控胶质细胞活化增殖对胶质细胞功能、轴突再生微环境及神经血管单元损伤与修复的影响。14、研究胶质细胞活化与脑缺血后海马迟发性神经元死亡（DND）的关系。15、研究胶质细胞功能紊乱与其糖代谢活动的关系；研究调控胶质细胞糖代谢活动的神经保护、促进损伤修复和功能重建的作用。16、研究组胺对脑缺血后星形胶质细胞谷氨酸代谢功能的作用。17、胶质细胞miRNA及候选靶基因在神经损伤修复中的作用。18、利用分子生物学技术过表达胶质细胞中Wnt3和Wnt5，进一步研究这些分子与血管-神经-胶质单元在神经损伤中的作用。19、用体外培养模型确定氧化损伤后EPC能否减少血管内皮细胞的通透性，并增强血管内皮细胞的存活。20、实施sr39tk-I-fluc基因标记干细胞大鼠脑缺血模型移植治疗，评价治疗效果，建立和完善治疗模型。21、神经电生理检测膀胱储尿期和排尿期大鼠脑桥、前额叶等大脑储尿排尿相关区域神经元自发放电频率以及用假狂犬病毒逆行示踪观测脑桥、下丘脑外侧核等大脑储尿排尿相关区阳性神经元分布及阳性神经元数目。22、正常及受损神经回路的分离及编码的解析。1、阐明胶质细胞吞饮活动的分子机制和病理生理意义；阐明小胶质细胞迁移调控的新的信号转导机理。2、揭示胶质细胞特异分泌蛋白在神经损伤修复过程中的作用机制；3、明确星形胶质细胞激活过程中细胞增殖的机制；明确星形胶质细胞激活过程中细胞增殖对神经再生的作用。4、发现ATP可通过P2X1受体激活或诱导小胶质细胞凋亡的分子机制。5、明确脑脊索损伤中Rheb/mTOR的作用机制。6、初步明确胶质细胞对脊髓运动神经元轴突再生的影响。7、建立起稳定的皮质脊髓束剥夺后红核脊髓束再损伤的动物模型。8、获得斑马鱼视神经再生过程中各种胶质细胞反应表达模式；初步鉴定、分析斑马鱼zMAG对视神经再生是否具有抑制作用。9、鉴定应用碳酸锂上调视网膜内BDNF表达水平，两种不同的治疗方案促进再生视神经终末在上丘内重建形态学突触样结构，并以视觉电生理手段研究视觉功能的部分恢复。10、初步明确胶质细胞在脑缺血后神经血管单元损伤与修复中的作用与机制。11、阐明脑缺血后海马迟发性神经元死亡的机制。12、寻找和发现具有药理意义的神经保护、促进损伤修复和功能重建的新途径和药物干预