第四节金黄色葡萄球菌检验.pptx

金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起多种严重感染。有“嗜肉菌的别称。概况葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄。生物学特性生物学特性菌体形态及培养特征菌体形态及培养特征 大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件。生物学特性生物学特性菌体形态及培养特征菌体形态及培养特征大多数菌株最适温度30-37，最适pH为7.0-7.5；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。一般用含10%氯化钠的大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；生物学特性生物学特性生化特征生化特征在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质，触酶阳性。致病菌可产生凝血浆酶。触酶试验（过氧化氢酶试验）触酶试验（过氧化氢酶试验）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。生物学特性致病性金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶毒素和侵袭性酶：a.a.溶血素溶血素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶：脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.e.肠毒素肠毒素：引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。葡萄球菌皮肤感染致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。分布在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20-22放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。流行病学季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。流行病学 金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。流行病学肠毒素形成条件：存放温度，在37C内，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。耐受力几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用肠毒素可耐受100 30分钟不被破坏。对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。检验程序与操作方法检验程序与操作方法根据中华人民共和国国家标准：食品卫生微生物学检验 GB4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验操作流程操作流程检样检样25g(mL)+稀释液稀释液225mL，均质，均质血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验7.5%氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤BHI肉汤和营养琼脂斜面肉汤和营养琼脂斜面Baird-Parker平板，血平板平板，血平板涂片染色涂片染色361，18h24h结果报告结果报告361 B-P平板平板18h24h或或45h48h观察溶血观察溶血血平板血平板 18h24h检测步骤检测步骤增菌增菌利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌。检测步骤检测步骤分离分离血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。检测步骤检测步骤分离分离BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素。丙酮酸钠是一种生长促进剂。亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色。卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环。甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。检测步骤检测步骤分离分离在BP平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。检测步骤检测步骤-鉴定鉴定金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。25g样品样品+225ml 生理盐水生理盐水 5mL样品匀液（样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤胰酪胨大豆肉汤血平板血平板36 1 24hr 镜镜 检检 营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验 报告结果报告结果 定性定性检测检测36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板平板25g样品样品+225ml 生理盐水生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度各取选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入加入3管胰酪胨大豆肉汤管胰酪胨大豆肉汤将有生长的管划线接种将有生长的管划线接种36 1 48hr 镜镜 检检 营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验 报告结果报告结果 MPN/g(mL)定量定量检测检测（MPNMPN法）法）法）法）36 1 48hr 36 1 24hr 36 1 6hr 适用于检测可能含适用于检测可能含有有少量少量金黄色葡萄金黄色葡萄球菌，却带有球菌，却带有大量大量竞争菌竞争菌的样品的样品梯度稀释梯度稀释 25g样品样品+225ml 生理盐水生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度分别取选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面接种之至表面干燥的干燥的BP平板（如平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种平板计数（分别记录每种类型的菌落数）类型的菌落数）36 1 48hr 镜镜 检检 营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验 报告结果报告结果 金葡菌数金葡菌数/g(mL)定量定量检测检测（平板法）（平板法）（平板法）（平板法）每种类型至少选取一个菌落每种类型至少选取一个菌落 36 1 24hr 36 1 6hr 适用于检测金黄色葡萄适用于检测金黄色葡萄球菌数球菌数不小于不小于10/g10/g（mLmL）的食品的食品梯度稀释梯度稀释 PetrifilmTM测试片法检验程序检样检样25g(mL)+225mL25g(mL)+225mL稀释，匀质，稀释，匀质，1010倍系列稀释倍系列稀释选择适宜稀释度的样品匀液，各取选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL1mL分别加入纸片分别加入纸片36136124242h2h判读判读没有菌落没有菌落只有典型紫红色菌落只有典型紫红色菌落将所有紫红色菌落计数将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌除典型紫红色菌落外其他除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落颜色的菌落加入确认反应片，加入确认反应片，361361，培养，培养13h13h有粉红色菌晕的菌落计数有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌报告报告金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以直接完成鉴定和计数。