分子生物学在医学检验中的临床应用及前景.doc

分子生物学在医学检验中的临床应用及前景
分子生物学在医学检验中的临床应用及前景
班级：2013级科硕6班
专业：临床检验诊断学
姓名：姜世涛
学号：2
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分子生物学是一门正在蓬勃发展的学科，新技术和应用条件的不断出现，为检验医学的发展提供了崭新的时代并提供新的机遇和挑战。 分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中，同时也逐渐渗入数理科学、结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学，研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、兔疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。在结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学蓬勃发展形势下，分子诊断学技术将会取得突破性进展。
一．利用分子生物学技术检测样品中核酸水平
PCR[1]技术是目前应用较广泛和成熟的临床检测方法，在法医学、常见传染病、性病、寄生虫和优生优育等领域有很高的应用价值，尤其对肝炎病毒的早期诊断。
1．核酸分子杂交技术和基因芯片技术
核酸分子杂交技术也称为基因探针技术，利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。目前基因芯片技术可广泛应用在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面。另外，现已获得一些微生物的全基因序列，包括百余种病毒，多种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌及实验室常用的大肠杆菌等)和一些酵母等。因此，将一种或多种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块基因芯片上，可快速、简便地检测出病原体，判断侵入机体引起感染性疾病的病原微生物(病毒、细菌或寄生虫等)，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。
2．单核苷酸多态性分析(SNP)技术
在人群中，个体基因的核苷酸序列存在差异性，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中。如果在某个家庭中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种”遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的”身份证”，因此，基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析技术为临床检测提供了依据。SNP是一种最常见的遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占90％。SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于：它不再以”长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果，因此SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管SNP检测在搜寻疾病基因方面有潜在的价值，但实际应用中却比人们想象的要难得多，它需要花费大量的时间进行筛查，才能建立可靠的SNP分析图谱。
3．microRNA是潜在的临床诊断工具
microRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是负调控基因表达。在正常组织中，miRNA转录，加工，结合到靶mRNA的互补位点，通过抑制蛋白翻译或是改变mRNA的稳定性来抑制基因表达，维持细胞生长、增殖、分化和死亡的正常进行。不同miRNA的分布有组织特异性，因此在生理和病理条件下，miRNA的表达水平存在差异。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步骤的缺陷造成的，而这最终将导致不适当的miRNA的靶蛋白的表达。最后的结果可能导致过度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或者去分化，引起肿瘤的形成。最近的证据表明，miRNA突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中，大约50％ 在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。例如，mir-125b一1，线虫lin一4的同源基因，在染色体的1lq24脆性位点，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中有缺失。若能确定多种肿瘤的miRNA表达谱特征库，可以帮助诊断和治疗肿瘤。由于miRNAs可以从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库建立成为可能。在此基础上，用特定的miRNAs表达差异图谱，还可以用于预测病人的预后。另外从治疗的角度，miRNA表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。
二、蛋白组学技术在临床检验中的应用
随着生物体全基因组序列的解析，特别是人类基因组序列草图的完成，基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学，因此在上世纪90年代中期，蛋白质组学正研究成为基础研究的重要支柱。蛋白组学是在基因组学之后又一组学，其发展之迅速，是由于其能够较为全面的考察蛋白层面的表达情况，有利于获得各种蛋白、多肽因子等信息 从而对相关机制进行更深入的研究[2]。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性，虽然可以通过PCR、基因芯片等方法显示生物体的基因水平，但mRNA水平(包括mRNA的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。由此可见，对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在生理和病理等不同条件下，其表达也不同。若能获得与某种疾病相关的蛋白水平的差异表达信息，将为临床诊断、治疗和预后提供有力依据。
1．蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行”杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的”杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。例如免疫芯片，是一种特殊的蛋白质芯片，它在临床分子诊断学有着明显的发展潜力，如肿瘤标志的检测、不同激素的测定，自身免疫性疾病中多种自身抗体或抗原的检测和超敏反应中多种过敏原的筛查等。
2．液体芯片飞行时间质谱技术在临床检测中的应用根据探针标记和色谱分析的原理，液体芯片飞行时间质谱主要由两部分组成：磁珠部分即液体芯片部分；飞行时间质谱仪部分，用于获取磁珠捕获的蛋白质质量和含量，根据不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，被测定的蛋白质以一系列波锋的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图，可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。
液体芯片一飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，用于预测未知样品的归属。液体芯片飞行时间质谱技术主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。一方面，该技术能够在生物液体中检测指示特异疾病的生物标志物模式或生物标志物谱，另一方面，该技术还可以鉴定单个的生物标志物候选物。在哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所中，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。
应用该技术可协助诊断多种遗传性代谢紊乱疾病，如各种氨基酸代谢失常血症，包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症；短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。由于液体芯片飞行时间质谱技术具有准确度高、快速、高通量、灵敏度高、重复性好、分辨率高、检测费用低等特点，是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具。
三．分子生物芯片技术在医学检验中的应用
随着人类基因组计划(HGP)的完成，蛋白质组计划也已经启动，基因序列数据、蛋白序列和功能数据以惊人的速度增长，而传统的生物技术已经不能满足数据倍增的要求，生命科学需要更快捷、更准确的自动化的生物技术，而生物芯片在这种情况下应运而生。生物芯片(biochip)的概念虽源于计算机芯片但不同于计算机芯片。狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核昔酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片(如硅片、玻璃、塑料等)表面以点阵方式固定的一系列可寻找的识别分子，点阵中每一个点都可视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法、同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。而广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件。生物芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。经过十多年发展，生物芯片技术已日臻完善，其应用前景非常广阔，因其具有技术操作简易、自动化程度高、检测目的分子数量多、高通量等特点，为“基因组计划”时期基因功能的研究及科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。在临床检验医学方面，生物芯片技术已经被应用于病毒、细茵的检测自身兔疫性疾病的兔疫标志物的检测。遗传性疾病的检测及肿瘤免疫标志物的单一检测及其联检等方面。甘志远等[3]通过呼吸道斑点试验芯片法检测呼吸道病毒抗体具有简便快速、灵敏度和特异度高等优点，是临床呼吸道病毒感染辅助诊断的有效方法。值得推广使用生物芯片具有操作简单、信息量大、节约试剂、减少误差、诊断快速的特点。在临床诊断、科学研究和流行病学筛选中具有广泛的应用前景，它的的诞生也为人们提供了一种高通量、高效率的肿瘤学研究手段[4-6]。
五．分子生物纳米技术在医学检验中的应用
1. 纳米科学技术是20世纪末期刚刚诞生并正在崛起的新科技。通过直接操纵和安排原子、分子创制新物质，纳米技术与医学相结合，促进了基础医学研究技术的完善、临床诊断技术的革新及治疗水平的提高[7]。通过应用纳米技术，在DNA检测时，检测方法更加简便、快速、准确。美国NASA Ames Center for Nanote Chnology与中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室合作，将碳纳米管用于基因芯片，样本需要量低于1000个NDA分子（传统DNA检测的样本需要量超过106个DNA分子）； 需要的样品量更少，可免去传统的PcR扩增步骤；结果可靠、重复性好、操作简单、易实现检测自动化[8]。免疫分析加上磁性修饰已成功地用于各种生物活性物质和异生质，如药物、致癌物等的检测。将特异性抗体或抗原固定到纳米磁球表面，并以酶、放射性同位素 荧光染料或化学发光物质为基础所产生的检测与传统微量滴定板技术相比具有简单、快速和灵敏的特点。霍美俊等[9]利用抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒，同时具有可在病毒感染的细胞周围特异性富集和磁颗粒可在交变磁场下感应升温的双重功能，将其作为磁感应热疗的靶向介质，有望研制出病毒感染性疾病磁感应热疗的靶向介质。为寻求一条快速诊断EV71病毒感染的新方法，纳米细胞分离技术的出现有助于解决生物医学中快速获取细胞标本的难题。应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌患者循环血液中的肿瘤细胞，可监测肺癌的转移情况。
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六．分子生物学技术在临床检测应用中的问题
疾病的发生是由于人体受内外因素的影响，导致机体细胞、组织或器官功能紊乱，归根到底是核酸、蛋白等分子水平表达异常，由此可见，利用分子生物学技术进行临床检测是协助临床诊断和治疗的必不可少的工具。但由于分子生物学技术不仅对临床样品的处理有较高要求，而且对检测人员的技术水平也有要求，这就涉及到从标本收集、处理、检测和分析等多个环节的系统化和规范化，为此，我国已制定了临床实验室定量测定室内质量控制指南。
利用分子生物学技术进行临床监测，在某些情况下可能存在一定困难，例如与核酸相比，蛋白和多肽作为生物标志的一个优势是它们能够很容易的在血液、尿液和其他生物体液中找到。这些类型的样品很容易获得，并代表了含有丰富的具有潜在信息的生物学信息分子。但从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比核酸技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。miRNA虽然是新兴的研究领域，但它们与疾病的相关性日益受到人们的重视，相信随着基础研究对miRNA不断深入的认识，miRNA必将成为临床检测中的手段之一。
七．参考文献
[1] 王海英.分子生物学技术在医学检验中的应用发展［J］.当代医学2011,17（6）16.
[2] 解福生，李欢.蛋白组学在心血管方面的研究进展 .医学信息(中旬刊), 2011,8,3812-3813.
[3] 甘志远，颜云盈，朱心智.生物芯片在婴幼儿呼吸道病原体感染诊断中的应用[J].内科,2011,6(3):215-216.
[4] 王新允，袁玲，郑海燕等.肺癌中FHIT蛋白表达细胞芯片的研究[J].中国肺癌杂志,2009,12(2):131-134.
[5] 朱抿，于军，周文利等.生物芯片技术在肺癌研究中的应用价值[J].中国肺癌杂志,2011,14,5:441-445.
[6] 张战，朱波，林治华.生物芯片技术在肿瘤研究中的应用[J].重庆医学,2011,5 (4):493-495..
[7] 曲秋莲，张英鸽.纳米技术和材料在医学上应用的现状与展望[J] .东南大学学报,医学版,2011,30(1):157-163.
[8] 张阳德，纳米技术与外科.中华实验外科杂志[J].2004,21(10):1159.
[9] 霍美俊，张长清，闰妍等.抗EV71多克隆抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒对病毒的特异性富集[J] .科技导报,2010,28(16):25-30.