重组体克隆筛选和鉴定.pptx

一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。第一节 载体表型选择法1.原理：原理：pBR322（1）四环素）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3.选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1.原理：原理：载体载体上有一段上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的）的）的 片段片段片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。的插入位点。的插入位点。受体菌基因组受体菌基因组受体菌基因组受体菌基因组中有突变的中有突变的中有突变的中有突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片片片片段缺失）。可以被段缺失）。可以被段缺失）。可以被段缺失）。可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。假阴性：假阴性：如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有的倍数并且没有中止密码；（不破坏中止密码；（不破坏 肽）。肽）。2.选择过程-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：第二节 根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量Marker载体载体重重组组克克隆隆二、酶切电泳筛选法1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。ABA或或B筛选过程三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。2500bp2500bp2000bp2000bp1500bp1500bp1000bp1000bp500bp500bp300bp300bp1 2 3 4 5 6 7 8从含有从含有100ug/mL氨苄青霉素抗性的氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，挑取白色菌落做菌落固体培养基平板上，挑取白色菌落做菌落PCR。第四节第四节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原一、原理：理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补配对原则退火形成双链，温度及离子强度等），可按碱基互补配对原则退火形成双链，此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是待测的核酸序列此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段（核酸探针）。将待测核酸变性和用于检测的已知核酸片段（核酸探针）。将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜上，用经标记示踪后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜上，用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交，该探针只能与互补的特异核酸牢的特异核酸探针与之杂交，该探针只能与互补的特异核酸牢固结合，而其他的非特异结合将被洗去。最后，示踪标记将固结合，而其他的非特异结合将被洗去。最后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异指示待测核酸中能与探针互补的特异 DNA 片段所在的位置。片段所在的位置。二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上方法的不同，可将该方法分为菌相支持物上方法的不同，可将该方法分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern 印迹杂交和印迹杂交和 Northern 印迹杂交四类，这四印迹杂交四类，这四类方法的主要技术路线如图所示类方法的主要技术路线如图所示 原位杂交筛选原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.放射性抗体检测法过程二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1.原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶192.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性）。的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）临床检验常用的单抗四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。的方法检测胶上的蛋白质泳带。1.原理：与与Southern或或Northern杂交方法类似，但杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。用标记的二抗。经过经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程第六节 DNA的序列分析已讲，不多做解释