微生物的培养与应用课件.pptx
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1、u考点40 微生物的培养、分离及计数u考点41 传统发酵技术的应用第十五章第十五章 微生物的培养与微生物的培养与应用用l高考考法突破考法1 微生物的培养与纯化l应试基础必备u考点40 微生物的培养、分离及计数考法2 微生物的分离、筛选与计数l应试基基础必必备(1)培养基概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养物质。成分:一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。培养基的制备:计算称量溶化灭菌倒平板。(2)无菌技术关键:防止外来杂菌的入侵。方法:实验室中常用紫外线或化学药物消毒,如用酒精擦拭双手;灭菌的方法主要有灼烧灭菌
2、、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。1微生物的培养微生物的培养(3)实验操作制备固体培养基a步骤:计算称量溶化灭菌倒平板。b倒平板操作时待培养基冷却至5050左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。纯化菌种a原理:在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个单个菌落,这个菌落就是一个一个纯化的细菌菌落。b方法:平板划线平板划线法法、稀释涂布平板稀释涂布平板法法。菌种的保藏a临时保存:固体斜面培养基上4保存,菌种易被污染或产生变异。b甘油保存:甘油瓶中20冷冻箱中保藏。2土壤中分解尿素的土壤中分解尿素的细菌的分离与菌的分离与计数数(1)筛选菌株原理:人为提供有利目的菌生长的条件,同时抑制或阻止抑制或阻止其他
3、微生物的生长。(2)统计菌落数目的方法显微镜直接计数法a原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积一定容积的样品中微生物的数量。b方法:用计数板计数。c缺点:不能区分死菌与活菌。间接计数法(活菌计数法)A原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。B计算公式:每克样品中的菌株数(CV)M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。C操作a设置重复组,增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确,一般选择菌落数在303
4、00的平板进行计数。(3)实验流程:土壤取样制备培养基微生物的培养与观察细菌的计数。3培养基培养基对微生物的微生物的选择作用作用(1)纤维素酶纤维素酶是一种复合酶,它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,具有催化分解纤维素的作用,其作用过程如下:(2)纤维素分解菌的筛选原理以纤维素作为唯一碳源的选择培养基上,刚果红纤维素红色复合物,纤维素分解菌可分泌纤维素酶,分解纤维素使红色消失,出现透明圈。即:可根据透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)土壤中纤维素分解菌的筛选流程土壤取样(要在富含纤维素的环境中取样)选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。l高考考法突破高考考法突破
5、1.1.对培养基的认识对培养基的认识考法考法11微生物的培养与纯化微生物的培养与纯化营养物质含义作用主要来源碳源能提供碳元素的物质构成生物体的物质,异养生物的能源物质无机物:CO2、NaHCO3;有机物:糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等氮源能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物无机物:N2、NH3、铵盐、硝酸盐;有机物:尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的成分维生素、氨基酸、碱基等水细胞生命活动必不可少的物质不仅是良好的溶剂,还是结构物质培养基、大气、代谢产物无机盐提供除碳、氮元素以外的各种重要元素,包括某些大量元素细胞内的组成成分;生理调节物质;某些化能
6、自养型细菌的能源;酶的激活剂等培养基()(1)培养基的成分(2)培养基的分类划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂,如琼脂对微生物分离、鉴定等用途选择培养基培养基中加入某种化学物质,用来抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养和分离出特定微生物(如分离细菌和真菌,可以在培养基中加入青霉素)鉴别培养基根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物,如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有,则菌落呈黑色并带有金属光泽)(3)培养基的配制原则目的要明确:根据微生物的种类、培养目的等选择原料配制培
7、养基,如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。营养要协调:注意各种营养物质的浓度和比例。pH要适宜:各种微生物适宜生长的pH范围不同。2.2.无菌技术操作的方法无菌技术操作的方法概念常用方法应用的范围消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法:在100 下煮沸56 min一般物品巴氏消毒法:7075 煮30 min或在80 煮15 min一些不耐高温的液体,如牛奶化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线消毒法:30 W紫外灯照射30 min接种室灭菌使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼烧
8、灭菌:酒精灯火焰接种工具的灭菌干热灭菌:160170 下灭菌12 h玻璃器皿、金属器具的灭菌高压蒸汽灭菌:121 下灭菌1530 min培养基及容器的灭菌3.3.平板划线法和稀释涂布平板法对大肠杆菌的纯化的比较平板划线法和稀释涂布平板法对大肠杆菌的纯化的比较平板划线法稀释涂布平板法示意图平板划线法稀释涂布平板法注意事项第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环进行灭菌,划线操作结束仍需灼烧接种环(灭菌的目的各不相同:第一次操作是为了杀死接种环上原有的微生物;每次划线之前灭菌是为了杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端;划线结束后灭菌是为了杀死接种环上残存的菌种
9、,避免细菌污染环境和感染操作者)。灼烧接种环之后,要冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力要适当,防止用力过大将培养基划破稀释操作时:每支试管及其中的9 mL水、移液管均需灭菌;操作试管口和移液管应在离火焰1处涂布平板时:a.涂布器用70%的酒精消毒,取出时,多余酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃;b.不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精;c.酒精灯与培养皿距离要适合,移液管头不要接触任何物体缺点不易分离出单个菌落,不能计数能使单菌落分离,便于计数,但统计样品中菌落的数目往往比实际数目低(因为当两
10、个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落)课标全国理综201639,15分某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生的乳酸能溶解酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题:培养基中的碳酸钙。回答下列问题:(1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用 对泡菜滤液进行梯度稀释,进行梯度稀释的理由是 。(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有 和 。分离纯化时应挑选出 的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在-20 长期保存时,菌液
11、中常需要加入一定量的 (填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。例【解析解析】(1)分离纯化乳酸菌需采用稀释涂布平板法,在稀释度足够高的菌液中,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而在培养基上形成单菌落。为避免引入杂菌,必须用无菌水进行稀释。(2)据题意可知,只有乳酸菌能产生乳酸溶解碳酸钙,加入碳酸钙的培养基可作为鉴别培养基,便于对乳酸菌进行筛选鉴定;此外,加入碳酸钙也可中和产生的酸,有利于乳酸菌的生存。(3)细胞冷冻保存时,加入保护剂甘油可使冰点降低,在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,可避免因细胞的机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等因素导致细胞
12、死亡。【答案答案】(1)无菌水泡菜滤液中菌的浓度高,直接培养很难分离得到单菌落(2)鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸)具有透明圈(3)甘油考法考法22微生物的分离、筛选与计数微生物的分离、筛选与计数l高考考法突破高考考法突破1 1微生物的分离微生物的分离(1)分离原理利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”,专门在培养基中加入该营养物质,使其成为一种加富(或营养)培养基。利用分离对象对某种物质的抗性,在培养基中加入抑制物,原来占生长优势的微生物受抑制,而分离对象则占生长优势,从而使其得到分离。(2)常见的分离微生物的方法改变培养基中的营养成分,如培养基中缺乏氮源时,可以分离固氮微生物,利用富含纤维素
13、的培养基分离纤维素分解菌;在尿素为唯一氮源的培养基中,分离尿素分解菌等。当培养基中加入抗生素时,如加入青霉素、链霉素,可以抑制细菌的生存,从而分离出真菌等真核微生物。2.2.微生物的筛选微生物的筛选(1)利用透明圈筛选微生物抗生素与透明圈的关系:用含抗生素的滤纸片均匀置于平板培养基上的不同位置,某种细菌形成的透明圈越大,说明该细菌对该抗生素越敏感,抗生素抑菌能力越强。若不出现透明圈,说明该细菌对该抗生素不敏感。分解圈(或透明圈)的大小与降解能力的关系:在固体培养基中加入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养基背景。接种培养后待筛选的菌落周围就会形成分解圈(或透明圈),分解圈
14、(或透明圈)的大小反映了菌落利用此物质的能力。常作为初步筛选菌落的快速方法。如在培养基中加入可溶性淀粉、酪素或原油可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或降解原油能力的大小。(2)菌株筛选原理的比较土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物示意图常用选择培养基进行筛选,即提供有利于目的菌株生长的条件,如营养、温度、pH等,同时抑制其他微生物的生长刚果红染色法,即在含有纤维素的培养基中,加入刚果红时,刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后,该复合物不能形成,培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈(1)直接计数法常用的是显微镜直接计数法。但不能区分死细胞与活细胞,应用范围狭窄,难以
15、计数微小的细菌。(2)间接计数法原理:常用稀释涂布平板计数法,当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作:实验时,每一浓度至少涂布3个平板,以增强实验的说服力和准确性。计数规则:选择菌落数在30300间的平板进行计数。计算方法:每克样品中的菌株数=(CV)M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。3 3微生物数目的统计方法微生物数目的统计方法例四川理综201610题节选如图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程,请回答下列问题:(1)图
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