华东理工大学现代发酵调控学发酵过程优化.pptx
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1、发酵的定义 狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。过程。广义则将发酵看作是微生物把一些原料养广义则将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。径转变成所需产物的过程。发酵过程优化发发酵酵是是一一种种很很复复杂杂的的生生化化过过程程,其其好好坏坏涉涉及及诸诸多因素。多因素。除除了了菌菌种种的的生生产产性性能能,还还与与培培养养基基的的配配比比,原原料料的的质质量量,灭灭菌菌条条件件、种种子子的的质质量量、发发酵酵
2、条条件件和过程控制等有密切关系。和过程控制等有密切关系。因因此此,不不论论是是新新,老老品品种种,都都必必需需经经过过发发酵酵研研究究这这一一关关,以以考考查查其其代代谢谢规规律律、影影响响产产物物合合成成的因素,优化发酵工艺条件。的因素,优化发酵工艺条件。发酵过程优化发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约,同一生产菌种和培养基配方,不制约,同一生产菌种和培养基配方,不同厂家的生产水平也不一定相同。同厂家的生产水平也不一定相同。这是由于各厂家的生产设备,培养基的来这是由于各厂家的生产设备,培养基的来源,包括水质和工艺条件各不尽相同。源,包括水质和工艺条件各
3、不尽相同。公用系统的成本公用系统的成本不同,会采用不同工艺。不同,会采用不同工艺。发酵过程优化 通通常常,菌菌种种的的生生产产性性能能越越高高,其其生生产产条条件件越难满足。越难满足。高高产产菌菌种种对对工工艺艺条条件件的的波波动动往往往往比比低低产产菌菌种种更敏感更敏感。掌掌握握生生产产菌菌种种的的代代谢谢规规律律和和发发酵酵调调控控的的基基本本知知识识对对生生产产的的稳稳定定和和提提高高具具有有重重要要的的意义。意义。微生物发酵过程培养方式微微生生物物发发酵酵过过程程可可分分为为分分批批、补补料料-分分批批和和半连续半连续(发酵液带放发酵液带放)和连续等几种方式。和连续等几种方式。不同的培
4、养技术各有其优缺点。不同的培养技术各有其优缺点。了了解解生生产产菌菌种种在在不不同同工工艺艺条条件件下下的的细细胞胞生生长长、代代谢谢和和产产物物合合成成的的变变化化规规律律将将有有助助于发酵生产的控制。于发酵生产的控制。分批培养(batch)分批发酵 分分批批发发酵酵是是一一种种准准封封闭闭式式系系统统,种种子子接接种种到到培培养养基基后后除除了了气气体体流流通通外外发发酵酵液液始始终终留在生物反应器内。留在生物反应器内。在在此此简简单单系系统统内内所所有有液液体体的的流流量量等等于于零零,故由物料平衡得式故由物料平衡得式5-15-3的微分方程:的微分方程:分批发酵dX/dt=X (5-1)
5、dS/dt=qS X (5-2)dP/dt=qP X (5-3)式中X为菌体浓度(g/L);t 为培养时间(h):为比生长速率(1/h);S为基质浓度(g/L);-qS 为比基质消耗速率(g/g)/h;P为产物 浓 度(g/L);qP为 比 产 物 形 成 速 率(g/g)/h。分批发酵 分批发酵过程一般可分批发酵过程一般可粗分为粗分为4期,即停滞期,即停滞(适应适应)期、对数期、对数(指数指数)生长期、静止生长期、静止(稳定稳定)期和死亡期;期和死亡期;也可也可细分为细分为六期:即停滞期、加速期、六期:即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期,如对数期、减速期、静止期和死亡期,如图图
6、5-1所示。所示。分批发酵 工工业业生生产产从从发发酵酵产产率率和和发发酵酵指指数数以以及及避避免免染菌考虑,希望尽量缩短适应期。染菌考虑,希望尽量缩短适应期。在停滞期(I),即刚接种后的一段时间内,细胞数目和菌量不变,因菌对新的生长环境有一适应过程,其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。分批发酵 加速期加速期()通常很短,大多数细胞在此期的比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。如这时菌已完全适应其周围环境,有充足的养分而又无抑制生长的物质便进入恒定的对数或指数生长期指数生长期()分批发酵 在对数生长期的比生长速率达最大,在对数生长期的比生长速率达最大,可用可用 max
7、表示,指数生长期的长短主表示,指数生长期的长短主要取决于培养基要取决于培养基,包括溶氧的可利用包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。性和有害代谢产物的积累。分批发酵 在减速期在减速期()随着养分的减少,有害代谢随着养分的减少,有害代谢物的积累,生长不可能再无限制地继续。物的积累,生长不可能再无限制地继续。这时比生长速率成为养分、代谢产物和这时比生长速率成为养分、代谢产物和时间的函数,其时间的函数,其细胞量仍旧在增加细胞量仍旧在增加,但,但其其比生长速率不断下降比生长速率不断下降,细胞在代谢与,细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化,经短时间的减速后形态方面逐渐蜕化,经短时间的减速后进入生长静止进入生长
8、静止(稳定稳定)期。期。分批发酵 减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks值),亲和力高,即Ks值小,则减速期短。分批发酵静止期静止期(V),实际上是一种生长和死亡的动,实际上是一种生长和死亡的动态平衡,净生长速率等于零,即态平衡,净生长速率等于零,即 ,式中式中 为比死亡速率。为比死亡速率。此期菌体的次级代谢十分活跃,许多次级此期菌体的次级代谢十分活跃,许多次级代谢产物在此期大量合成,菌的形态也代谢产物在此期大量合成,菌的形态也发生较大的变化,如菌已分化,染色变发生较大的变化,如菌已分化,染色变浅,形成空胞等。浅,形成空胞等。分批发酵当当养养分分耗耗竭竭,对对生生长长有有害害代代谢谢物
9、物在在发发酵酵液中大量积累便进入死亡期液中大量积累便进入死亡期()。这时这时 ,生长呈负增长。生长呈负增长。工工业业发发酵酵一一般般不不会会等等到到菌菌体体开开始始自自溶溶时时才结束培养。才结束培养。发发酵酵周周期期的的长长短短不不仅仅取取决决于于前前面面五五期期的的长短还取决于长短还取决于Xo。分批发酵 将对数期称为生长期将对数期称为生长期(trophophase)。将静止期称为分化期将静止期称为分化期(idiophase)。生长期末为产物的形成创造了必要的条生长期末为产物的形成创造了必要的条件。件。分批发酵(1)(1)生长关联型生长关联型 根据产物的形成是否与菌根据产物的形成是否与菌体生长
10、同步关联,体生长同步关联,Pirt将产物形成动力学将产物形成动力学分为生长关联型和非生长关联型。分为生长关联型和非生长关联型。一般,一般,初级代谢产物初级代谢产物的形成与生长关联;的形成与生长关联;而而次级代谢产物次级代谢产物的形成与生长非直接关的形成与生长非直接关联。联。分批发酵qp=Yp/x 对与生长关联的产物形成,对与生长关联的产物形成,比产物形成比产物形成速率随比生长速率的增长而提高速率随比生长速率的增长而提高。这类产物通常是微生物的分解代谢产物,这类产物通常是微生物的分解代谢产物,如酒精。如酒精。由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产生的葡萄糖异构酶也属
11、于这一类型。生的葡萄糖异构酶也属于这一类型。分批发酵(2)(2)非非生生长长关关联联型型 此此类类型型的的产产物物形形成成只只与与细细胞的积累量有关,可用式胞的积累量有关,可用式5-9表示:表示:dP/dt=X (5-9)式式中中dP/dt为为产产物物形形成成速速率率(g/L)/h;为为比比例例常数。常数。由由此此式式可可见见,产产物物形形成成速速率率与与菌菌的的生生长长速速率率无无关关,而而与与菌菌量量有有关关。次次级级代代谢谢产产物物中中的的一一些抗生素的产物合成即属于这一类。些抗生素的产物合成即属于这一类。分批发酵分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影
12、响在在浓浓度度较较低低的的(AB)范范围围内内,静静止止期期的的细细胞胞浓浓度与初始基质浓度成正比,可用式度与初始基质浓度成正比,可用式5-10表达:表达:X=Y(SoSt)(5-10)式式中中So为为初初始始基基质质浓浓度度(g/L);St为为经经培培养养时时间间t的的基基质质浓浓度度(g/L);Y为为得得率率系系数数(g细细胞胞/g基基质质)在在A-B的区域,当生长停止时,的区域,当生长停止时,St等于零。等于零。方方程程5-10可可用用于于预预测测用用多多少少初初始始基基质质便便能能得得到到相应的菌量相应的菌量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在在C-D的的区区域域,菌菌量量不不随
13、随初初始始基基质质浓浓度度的的增加而增加。增加而增加。这这时时菌菌的的进进一一步步生生长长受受到到积积累累的的有有害害代代谢物的限制。谢物的限制。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响用用Monod方程可描述比生长速式中方程可描述比生长速式中 max是是最大比生长速率最大比生长速率(h-1);Ks 为基质利用常数为基质利用常数率和残留的率和残留的限制性基质浓度限制性基质浓度之间的关系:之间的关系:max S/(Ks+S)(5-11),相当于相当于 max/2时的基质浓度时的基质浓度(g/L),是菌对基质的亲和力的一种度量。是菌对基质的亲和力的一种度量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分分
14、批批培培养养中中后后期期基基质质浓浓度度下下降降,代代谢谢有有害害物物积累,已成为生长限制因素,积累,已成为生长限制因素,值下降。值下降。其其快快慢慢,取取决决于于菌菌对对限限制制性性基基质质的的亲亲和和力力大大小。小。Ks小小,对对 的的影影响响较较小小,当当St接接近近0时时,急急速速下降;下降;Ks大大,随随St的的减减小小而而缓缓慢慢下下跌跌,当当St接接近近0时时,才迅速下降到零,见图才迅速下降到零,见图5.4。分批发酵中重要参数的变化分批发酵的优缺点 对不同对象,掌握工艺的重点也不同。对不同对象,掌握工艺的重点也不同。对对产产物物为为细细胞胞本本身身,可可采采用用能能支支持持最最高
15、高生生长量的培养条件;长量的培养条件;对对产产物物为为初初级级代代谢谢物物,可可设设法法延延长长与与产产物物关联的对数生长期;关联的对数生长期;对对次次级级代代谢谢物物的的生生产产,可可缩缩短短对对数数生生长长期期,延延长长生生产产(静静止止)期期,或或降降低低对对数数期期的的生生长长速率,从而使次级代谢物更早形成。速率,从而使次级代谢物更早形成。分批发酵的优缺点 分分批批发发酵酵在在工工业业生生产产上上仍仍有有重重要要地地位位。采采用用分分批批作作业业有有技技术术和和生生物物上上的的理理由由,即即操操作作简简单单,周周期期短短,染染菌菌的的机机会会减减少少和和生生产产过过程程,产产品品质质量
16、易掌握。量易掌握。分分批批发发酵酵不不适适用用于于测测定定其其过过程程动动力力学学,因因使使用用复复合合培培养养基基,不不能能简简单单地地运运用用Monod方方程程来来描描述述生生长长,存存在在基基质质抑抑制制问问题题,出出现现二二次次生生长长(diauxic growth)现象。现象。分批发酵的优缺点如如对基质浓度敏感对基质浓度敏感的产物,或次级代谢物,的产物,或次级代谢物,抗生素,用分批发酵不合适,因其周期抗生素,用分批发酵不合适,因其周期较短,一般在较短,一般在13天,产率较低。天,产率较低。由于养分的耗竭,无法维持下去。据此,由于养分的耗竭,无法维持下去。据此,发展了补料发展了补料-分
17、批发酵。分批发酵。补料-分批发酵 补料补料(流加流加)-分批分批(fed-batch)发酵是在分发酵是在分批发酵过程中补入新鲜料液,以克服由批发酵过程中补入新鲜料液,以克服由于养分的不足,导致发酵过早结束。于养分的不足,导致发酵过早结束。由于只有料液的输入,没有输出,因此,由于只有料液的输入,没有输出,因此,发酵液的体积在增加。发酵液的体积在增加。(除取样外除取样外)目前工厂最常用的操作模式。目前工厂最常用的操作模式。Fed-batch准稳态补料-分批发酵恒恒化化器器的的稳稳态态和和补补料料-分分批批发发酵酵的的准准稳稳态态的的主主要要区区别别在在于于恒恒化化器器的的 是是不不变变的的,而而补
18、补料料-分分批批发发酵酵的的 是是降降低低的。的。补料-分批发酵 补补料料-分分批批发发酵酵的的优优点点在在于于它它能能在在这这样样一一种种系系统统中中维维持持很很低低的的基基质质浓浓度度,从从而而避避免免快快速速利利用用碳碳源源的的阻阻遏遏效效应应和和能能够够按按设设备备的的通通气气能能力力去去维维持持适适当当的的发发酵酵条条件件,并且能减缓代谢有害物的不利影响。并且能减缓代谢有害物的不利影响。减少初始配料体积,有利于消毒时液面减少初始配料体积,有利于消毒时液面控制。控制。比生长速率的最佳策略 比生长速率是过程的重要参数之一,表比生长速率是过程的重要参数之一,表征生物反应器的动态特性。征生物
19、反应器的动态特性。为了获得最大的细胞产量,应在培养期为了获得最大的细胞产量,应在培养期间使间使值最大。为此,应使培养基中的值最大。为此,应使培养基中的糖浓度保持在一最适范围。如没有现成糖浓度保持在一最适范围。如没有现成的在线葡萄糖监控仪,的在线葡萄糖监控仪,可控制可控制RQ值和乙值和乙醇浓度醇浓度。分批补料的优化 为了获得最大的产率为了获得最大的产率,需优化补料的策略。需优化补料的策略。通过一描述通过一描述比生长速率比生长速率与比生产速率与比生产速率之间的关系之间的关系的数学模型,藉最大原理的数学模型,藉最大原理(Maximum Principle)可容易获得比生长可容易获得比生长速率的最佳方
20、案。这可以从实际分批速率的最佳方案。这可以从实际分批-补补料培养中改变补料的速率,如边界控制料培养中改变补料的速率,如边界控制实现。实现。分批补料的优化 在分批培养的前期在分批培养的前期应维持在其最应维持在其最大值,大值,max,下一阶段下一阶段应保持在应保持在c上。这种控制策略可理解为上。这种控制策略可理解为细胞生细胞生长长和和产物合成产物合成的两阶段生产步骤。的两阶段生产步骤。分批补料的优化基因工程重组干扰素高密度高表达中比生基因工程重组干扰素高密度高表达中比生长速率的控制。长速率的控制。对重组大肠杆菌对重组大肠杆菌W3110(pEC901),当当 0.336h 0.336h 0.336h
21、-1-1,生成乙酸而且乙酸浓度随生成乙酸而且乙酸浓度随着比生长速率增大而增大。着比生长速率增大而增大。分批补料的优化 基因工程白蛋白生长相中比生长速率的基因工程白蛋白生长相中比生长速率的控制。控制。重组人血清白蛋白发酵过程生重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算长期的代谢计算生物工程学报,生物工程学报,Vol.16 No.5,2000。结合元素平衡和代谢平衡,。结合元素平衡和代谢平衡,建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型。期的数学模型。qgly=-0.05785-1.5184 可通过控制甘油补料速率来有效控制可通过控制甘油补料速率来有效控制半连续发
22、酵 在补料在补料-分批发酵的基础上加上间歇分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液放掉部分发酵液(行业中称为带放行业中称为带放)便便可称为半连续发酵。可称为半连续发酵。半连续发酵 带放带放(bleeding)是指放掉的发酵液和是指放掉的发酵液和其它正常放罐的发酵液一起送去提其它正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。炼工段。半连续发酵这是考虑到补料这是考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足,但由于有害代谢充养分或前体的不足,但由于有害代谢物的不断积累,产物合成最终难免受到物的不断积累,产物合成最终难免受到阻遏。阻遏。放掉部分发酵液,再补入适当料液不仅补放掉部分发酵液
23、,再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释,充养分和前体而且代谢有害物被稀释,从而有利于产物的继续合成。从而有利于产物的继续合成。半连续发酵应用 青霉素常用带放操作,实际上也同青霉素常用带放操作,实际上也同时将比生长速率控制在合适的数值。时将比生长速率控制在合适的数值。=0.012h=0.012h-1-1 使放罐体积往往大于发酵罐体积。使放罐体积往往大于发酵罐体积。半连续发酵的不足之处1)放放掉掉发发酵酵液液的的同同时时也也丢丢失失了了未未利利用用的的养养分和处于生产旺盛期的菌体;分和处于生产旺盛期的菌体;2)定定期期补补充充和和带带放放使使发发酵酵液液稀稀释释,送送去去提提炼的发
24、酵液体积更大;炼的发酵液体积更大;3)发发酵酵液液被被稀稀释释后后可可能能产产生生更更多多的的代代谢谢有有害物,最终限制发酵产物的合成;害物,最终限制发酵产物的合成;半连续发酵的不足之处4)一些经代谢产生的一些经代谢产生的前体前体可能丢失;可能丢失;5)有利于非产生菌突变株的生长。据有利于非产生菌突变株的生长。据此,在采用此工艺时必需考虑上述此,在采用此工艺时必需考虑上述的技术上限制,不同的品种应具体的技术上限制,不同的品种应具体情况具体分析。情况具体分析。连续培养 连连续续培培养养是是发发酵酵过过程程中中一一面面补补入入新新鲜鲜的的料料液液,一一面面以以相相近近的的流流速速放放料,维持发酵液
25、原来的体积。料,维持发酵液原来的体积。连续培养 连续培养系统又称为恒化器连续培养系统又称为恒化器(chemostat),因培养物的生长速率,因培养物的生长速率受其周围化学环境,即受其周围化学环境,即受培养基的受培养基的一种限制性组分一种限制性组分控制。控制。连续培养 微生物培养的动力学特性,它在恒微生物培养的动力学特性,它在恒化器中的行为可用一些常数,化器中的行为可用一些常数,max,Ks,Y和和Dcrit等描述。可采用的最等描述。可采用的最大稀释速率受大稀释速率受max值的影响;值的影响;Ks值值影响残留的基质浓度,从而影响菌影响残留的基质浓度,从而影响菌浓与可利用的最大稀释速率;浓与可利用
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