工业微生物原生质体育种和原生质体融合.pptx
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1、第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种第一节 原生质体育种一、原生质体再生育种出发菌株的选择菌种活化和与培养原生质体制备原生质体再生高产菌株分离复筛遗传性状鉴定菌种特性和发酵特性研究二、原生质体诱变育种菌种活化和与培养原生质体制备原生质体悬浮液稀释至一定浓度,取一定放入无菌平皿中 紫外灯下诱变处理 置暗处后处理 再生培养高产菌株分离复筛遗传性状鉴定菌种特性和发酵特性研究三、原生质体转化育种菌种活化和与培养 原生质体制备离心洗涤,取原生质体悬浮液1ml,2倍SMM浓缩液和质粒DNA各0.1ml,然后加入40%聚乙二醇4000ml,混匀后静置2min,离心,悬浮于1mlHCP培养几种,适
2、当稀释后分离在选择培养基上,双层平板培养,筛选转化子。第二节第二节 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种一、定义与意义一、定义与意义 细胞融合(Cell fusion)也叫细胞杂交是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。由于它不仅能产生同种细胞融合,也能产生种间细胞的融合,因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大,也被广泛应用于细胞生物学和医学研究的相关领域。基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为同核体,来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。从融合效果上,细胞融合包括:对称融合:即两个完整的细胞间的融合。不对称融合:利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质
3、失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。二、发展历史细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。1875年观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生的合并现象。1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。20世纪七十年代初,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合,开拓了植物细胞融合的研究。细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞伴随者细胞融合技术的成熟。20世纪80年代,真正意义上的细胞工程诞生了,细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。三、原生质体融合育种的特点、原生
4、质体融合育种的特点1)1)杂杂交交频频率率较较高高:细细胞胞壁壁去去除除后后在在高高渗渗条条件件下形成类似于球形的原生质体。下形成类似于球形的原生质体。2)2)受受接接合合型型或或致致育育型型的的限限制制较较小小:二二亲亲株株中中任任何何一一株株都都可可能能起起受受体体或或供供体体的的作作用用,因因此此有利于不同种属间微生物的杂交。有利于不同种属间微生物的杂交。3)3)遗遗传传物物质质传传递递更更为为完完整整:原原生生质质体体融融合合是是二二亲亲株株的的细细胞胞质质和和细细胞胞核核进进行行类类似似的的合合二二为为一的过程。一的过程。4)4)存存在在着着两两株株以以上上亲亲株株同同时时参参与与融
5、融合合形形成成融融合子的可能性。合子的可能性。5)5)有有可可能能采采用用产产量量性性状状较较高高的的菌菌株株作作融融合合亲亲株。株。6)6)提高菌株产量的潜力较大。提高菌株产量的潜力较大。7)7)有助于建立工业微生物转化体系。有助于建立工业微生物转化体系。四、细胞融合过程显微镜下的原生质体融合显微镜下的原生质体融合融合过程中细胞膜变化类脂质分子发生扰动和重排导致细胞桥的形成细胞质、核相互融合五、原生质体融合技术原生质体制备原生质体纯化原生质体融合融合子检出融合子鉴定(一)微生物原生质体制备1、定义及特点 定义:去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。特点:无细胞壁,可以方便地进行遗传操作、人工
6、诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性,能再生细胞壁。2、微生物细胞壁组成微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同,酶解处理的有效酶也不一样,因此要求根据微生物种类特性选择合适的酶。G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸G-:糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖真核细胞壁组成种类 纤维素 几丁质 其他多糖疫霉属 25 0 65毛霉属 0 9 44酵母属 0 1 60镰刀霉属 0 39 29裂褶菌数 0 5 81鬼伞属 0 33 503、制备原生质体的酶类自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶,如蛋清中的溶菌酶,蜗牛消化
7、酶,寄生性微生物合成酶。包括:纤维素酶酵母裂解酶几丁质酶商品酶:Novozyme234来自Trichoderma harzianumLywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶 4、影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1)1)菌体的前处理菌体的前处理 为为了了将将菌菌作作一一些些前前处处理理使使酶酶作作用用的的效效果果好好一一些,些,如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2)2)菌体的培养时间菌体的培养时间 选择增殖期的菌体,使细胞易于原生质体化。选择增殖期的菌体,使细胞易于原生质体化。3)3)酶浓度酶浓度 对对于于不不同同
8、种种属属的的微微生生物物,不不仅仅对对酶酶的的种种类类要要求求不不同同,对对酶酶的的浓浓度度也也有有差差异异。最最佳佳酶酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。浓度还随不同的生长期的菌体而变化。酶浓度合适,浓度太高对原生质体有破坏作用,影响原生质体的再生4)4)酶处理温度酶处理温度 :根据具体情况根据具体情况,细菌高细菌高,酵母酵母及霉菌稍低。及霉菌稍低。过高的温度使酶失活,原生质体失活;过低的温度酶活性不高,影响原生质体细胞膜稳定性5)5)破壁时的破壁时的pHpH值值:对离子强度影响较大对离子强度影响较大6)6)渗透压稳定剂渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中起到保护原生等渗透压在原生质体制备
9、中起到保护原生质体免于膨裂,有助于酶和底物的结合,质体免于膨裂,有助于酶和底物的结合,渗透压稳定剂多采用甘露醇,山梨醇,蔗渗透压稳定剂多采用甘露醇,山梨醇,蔗糖等有机物和糖等有机物和KClKCl和和NaClNaCl等无机物。等无机物。5、原生质体制备程序菌体培养:液体培养 固体培养收集菌体:过滤收集、离心收集无菌水冲洗洗涤菌体:等渗液冲洗等渗液与酶液相同酶解处理:保温酶解 稀释终止酶解,离心去酶过滤分离:过滤去掉为分界菌丝体查速离心:收集大小密度均一的原生质体,低速离心其沉淀物,高速离心弃上清液,的纯化原生质体。原生质体的保存较低的温度可以有效保持原生质体的活性;细菌:48小时放线菌:24小时
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