分子克隆.docx
《分子克隆.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子克隆.docx(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、分子克隆技术实验报告应用生物技术0801实验是由小组成员集体完成,实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员:余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日,共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出,详见分子克隆技术实验手册附录。一将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上摘要运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片段M812的质粒pU1301,用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA的质量,用限制性内切酶BamI和KpnI处理pU1301和pUC19,将纯化的载体pUC19与回
2、收的水稻DNA片段M812连接后,将重组的DNA分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a并在培养皿上培养。关键词碱裂法 琼脂糖凝胶电泳检测 亚克隆 感受态细胞 重组子的转化1 前言亚克隆,即是将已经获得的目的片段进行进一步分析,或者进行重组改造等过程。其基本过程包括:(1)目的片段和载体的制备;(2)目的片段和载体的连接;(3)连接产物的转化;(4)重组子筛选。本实验中的目的片段和载体均来自细菌质粒,因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程。碱裂解法,是1979年由Birnboim和Doly设计并
3、发表的经典质粒DNA提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状DNA发生变性,质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理,变性的染色体会沉淀,从而将质粒DNA与染色体DNA分开。在pH值为时,核酸分子带负电,在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带,因为质粒有三种构型,即线状
4、、环状、开环状。将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组,其包括载体及外源DNA片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。将重组DNA导入大肠杆菌细胞一般有两种方法CaCl2法和电转化法,本实验中采用CaCl2法。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞:利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/mg DNA。2 材料和方法携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌
5、菌液。携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌的培养先采用含相应抗生素的LA培养基,后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37培养。抗生素的使用浓度:氨苄青霉素,100g/ml;卡那霉素,50g/ml。Solution I; SolutionII; SolutionIII;苯酚/氯仿;异丙醇;ddH2O21. 取含有所需载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落,37过夜培养;2. 用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有相应抗生素的LB培养基中,37摇床250 r/min过夜培养;3. 吸取菌液,1200
6、0r/min离心1分钟,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次12000r/min离心1分钟收集菌体,尽量将菌液倒干净;4. 加入300ml 溶液 I,振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块);5. 加入300ml 溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟(最好不超过2分钟);6. 加入300ml 溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;7. 12000 g离心10分钟;8. 吸取800ml 上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;9. 12000 g 常温离心15分钟;10.
7、倒尽上清,加500 ml 75乙醇浸洗除盐,(放置片刻后倒去上清;或离心5分钟)11. 加40ml 灭菌超纯水溶解;12. 质粒的质量检测,-20保存。2.1.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳步骤 1.将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中,水平放置在工作台上,调整好梳子的高度;0.24 g琼脂糖于TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至温热时倒胶;3.凝胶凝固后,小心拔去梳子;DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中(上样缓冲液含甘油或蔗糖,利于DNA样品沉入点样孔中;含有电泳指示剂,以指示电泳的进程);5.将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动(注意点样孔
8、在电泳槽的负极一端);6.电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5 g/ml的溴化乙锭(EB)中浸泡1015 min,在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录;(上样缓冲液含甘油或蔗糖,利于DNA样品沉入点样孔中;含有电泳指示剂,以指示电泳的进程。)DNA片段在质粒载体中的克隆所抽提的载体质粒pUC19和携带外源片段M812的载体pU1301;限制性内切酶:BamH I和Kpn I;2.2.2 载体pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效应检测(50 ml反应体系,用1.5ml tube,冰上操作) DNA 30mlBamH I (10u/l) 1 mlK
9、pn I (10u/l) 1 ml 10buffer5 mlddH2O 13ml分别取5 ml 酶切产物用1.2%凝胶检测酶切效果;2.2.3 酶切产物pUC19的纯化步骤 1. 加入ddH2O 150 ml (扩大体积),加入200l氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀后离心10 min;2. 吸出上清,加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇,-20放置15分钟以上;3. 12000 rpm 4冷冻离心15分钟;4. 倒去上清,用75乙醇浸洗沉淀,风干后BAC DNA溶于10 ml ddH2O,
10、pUC18 DNA溶于20 ml ddH2O(1.5ml tube中);2.2.4外源DNA片段M812挖胶回收步骤(上海生工公司生产的柱式DNA胶回收试剂盒) 1. 通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开;2. 紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入离心管中;(注意:不含DNA 的胶尽可能切除,在长波长的紫外灯下切胶,并尽量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间)3. 按400l/100mg 胶的比例加入Binding Buffer II , 50-60C 水浴中10分钟,使胶融化,每2-3分钟混匀一次;(注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer
11、 II 的比例、增加融胶的时间,若胶块体积较大也需增加融胶的时间)4. 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10 柱中,放置2分钟,8000rpm离心1分钟;5. 取下UNIQ-10 柱,倒掉收集管内的废液,将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内,加入500l Wash Solution ,8000rpm 室温离心1分钟;6. 重复5步一次;7. 取下UNIQ-10 柱,倒掉收集管内的废液,将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内,12000rpm 室温离心15秒;8. 将UNIQ-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内,在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水
12、(),室温或37C 放置2分钟;(提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率);9. 12000rpm室温离心1分钟,离心管中的溶液即为回收的DNA 片段。2.2.5 连接反应(10l体系):外源DNA 4 ml目的载体DNA 4 ml10 buffer 1 mlT4 ligase (1U/ml) 1 ml 16 C 水浴保温过夜2.2.6.1 CaCl2感
13、受态细胞的制备步骤1. 前夜接种受体菌(DH5a),挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜(约16小时);2. 取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中,在37摇床上剧烈振荡培养约小时(300rpm);3. 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上操作4. 吸取培养好的菌液至离心管中,在冰上冷却10分钟;5. 4下4000rpm冷冻离心10分钟;6. 再吸取菌液,重复操作4、5;7. 弃去上清,加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟;8. 4下4000 rpm冷冻离心10
14、分钟;9. 弃去上清,加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;10. 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(70)。3结果和讨论DNA质量检测图1.质粒DNA质量检测图图1是质粒DNA提取后的凝胶电泳检测的图片,图中的各条带均可见表示所需质粒抽提成功,质粒DNA提取的质量一般。图片中1号为Puc19载体,图中可看到4条带,最靠近胶孔的为杂带,下边的3条带由胶孔至胶底依次为开环状质粒、线状质粒和超螺旋状质粒。图中2号为携带目标片段M812的载体pU1301,靠近胶孔有拖带现象,出现这种情况可能的原因是部
15、分DNA被降解。抽提质粒过程中,吸取上清时可能混入杂质,导致了1号泳道的情况,而2号泳道的降解可能是因为溶水后放置了太长时间导致,以后需要注意。1 2 3 4 图2.质粒酶切后凝胶电泳图(1为puc19,3为pu1301)图2是质粒经BamH I和Kpn I酶切后凝胶电泳的照片,可以看出质粒的酶切都比较理想。本组在双酶切实验中质粒切割较完全,可能原因是注入酶时较谨慎,未带入多余的酶,因此酶用量事宜,未引起星星活性。此外,当底物和酶等成分均加入完全后,本组在实
16、验中将其弹均,并进行短暂离心使其充分混匀,因此酶切结果较为理想。图3大肠杆菌感受态细胞转化结果转化结果,全被杂菌污染,出现蓝色自连菌落,成功转化菌落无法识别。本此实验中,培养皿的培养时间接近30小时,导致卫星菌落的产生。据资料显示,大肠杆菌在氨苄青霉素上的经验培养时间为12-16小时,若到达预期培养时间时依然未形成可见菌落,则可适当延长培养实验,直至长出饱满菌落。实验中,培养时间过长,导致细胞分泌的-内酰胺酶破坏了氨苄青霉素的活性,以致长出杂菌。并且由于最后涂皿时,无菌操作出现问题,导致材料污染杂菌。因此,我们在日后实验中,一定此次分子克隆实验结果较为理想,主要原因在于实验操作较为谨慎,各环节
17、的实验均进行得比较仔细。在质粒抽提阶段,本组特别加入了氯仿异丙醇抽提环节,提高了所提取质粒的纯度;在回收阶段,本组将所切的胶带再度进行切割,使其成为小块凝胶,便于其溶解,缩短的溶解时间;在感受态制备阶段,本组注重冰上操作和无菌操作,进入超净工作台前将手洗净,并用酒精棉球仔细擦拭,防止污染。因此,在今后进行相关操作时,应更加注重实验细节,从而能增加实验成功率。二,转基因水稻外源基因拷贝数检测摘要通过CTAB法提取水稻总DNA,经Hind III酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳并将其结果转移至硝酸纤维素尼龙膜上。用已制变性探针在膜上进行杂交后显色,则根据显色后的条带情况则测定转基因水稻外源基因拷贝数。
18、关键词CTAB法,总DNA,Southern印迹,地高辛;1 前言分子杂交技术,可以用于检测转基因水稻外源基因拷贝数。本实验中主要采用Southern杂交技术进行检测。Southern杂交是由Southern等人于1977年发明的一种检测DNA分子的一种方法,通过Southern印迹转移将琼脂糖胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用经过地高辛标记的探针进行分子杂交,在滤膜上找到与核酸探针也有同源序列的DNA分子。用于杂交的水稻总DNA由CTAB法抽提而来,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂,CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶,并稳定
19、存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用7075%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。由此可以得到纯度较高的转基因水稻总DNA。HindIII的酶切位点是AAGCTT,用HindIII处理后的总DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳后呈现连续的条带,便于进行杂交。杂交所用探针为地高辛所标记。地高辛(DIG)是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备,相比生物素则没有样本内源干扰之苦,很适合用于核酸非放标记检测。2
20、 材料和方法新鲜幼嫩转基因水稻叶片;CTAB,氯仿/异戊醇(24:1),95%乙醇,70%乙醇,3M NaAc,ddH2O;步骤1.采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻,研磨成细粉;2.取约左右细粉于离心管,加入1ml预热至95C以上的CTAB,混匀;3. 65C水浴中放置30分钟,每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性,促进内溶物释放);4.12000rpm离心2分钟; 600ml上清于新的离心管,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),上下颠倒混匀至下层有机相呈深绿色(约15-20分钟);6.12000rpm离心5分钟;450ml上清于新的离心管,加入两倍体积95乙
21、醇和1/10体积3M NaAc,轻轻的颠倒混匀至絮状沉淀形成;8.12000rpm离心10分钟;9.弃去上清。用500ml 70乙醇浸洗沉淀5分钟,除去离子及CTAB残余,弃上清,自然干燥;2O溶解。11.待总DNA充分溶解后取5ul,并加入2ul 6Loading Buffer在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳。根据染色后的条带检测总DNA抽提效果。2.1.4植物总DNA的酶切检测(20ml体系)DNA10 ml Hind3(10U/l)1 ml
22、 10buffer2 ml ddH2O 7 ml 37C 酶切过夜;电泳检测酶切效率:每样品1/10量上样,电泳检测(2ml 总DNA 酶切产物+1ml 10loading buffer+7 ml H2O)。加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应(加上样缓冲液终止酶切)22探针的地高辛标记模板DNA,去离子水,DiG-high Primer ;2.1.2地高
23、辛标记步骤(10l)1将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 l。2沸水浴或干浴98 C 10分钟,使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3充分混匀DiG-high Primer (1#管),并取2 l至变性DNA管,混匀并离心。437 C温育1小时或过夜(最大到不超过20小时)。5停止反应,65 C加热10分钟。l; 2.将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/l (原始浓度是5ng /l);3.将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1l点膜;C固定30分钟或紫外交链3-5分钟;5.将膜放入装有20ml Maleic acid buff
24、er 的塑料器皿中,室温2分钟;6.将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟;7.将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟;8.用10ml Washing buffer 洗2次,每次15分钟;9.在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟;10.将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动。;11.当斑点或带显示出来后,用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟,照相;2.3 Southern 印迹2.3.11材料以及用具固相支持物:硝酸纤维素膜;脱嘌呤试剂(
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 功臣 分子 克隆
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【可****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【可****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。