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Western blotting试验方法
1. 试剂配制
1.1 配胶溶液
（1） 1.0mol/L Tris·HCl（PH 6.8）
Tris (MW121.14) 12.11g
双蒸水 80ml（定容至100ml）
溶解后，用浓盐酸（5-10ml）调pH至6.8，最后用双蒸水定容至100ml，高温灭
菌后室温下保存。
（2）1.5mol/L Tris·HCl（pH 8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
双蒸水 200ml（定容至250ml）
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用双蒸水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
（3）10％ SDS（PH 7.2）
SDS 10g
双蒸水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
（4）10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
双蒸水 1.0ml
4℃保存，保存时间为1周。
（5）30％Acr/Bic（14.55：1）（PH<7.0）
丙稀酰胺（Acr） 29g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
双蒸水至 100ml
溶解后（37℃助溶），用NaIgene滤器(0.45μm孔径)过滤，检测溶液的pH值不大于7.0，4℃置棕色瓶中保存，使用时恢复至室温且无沉淀。
（6）TEMED
分装使用，避光保存，剧毒，挥发。
1.2 其它溶液
（1）裂解液 购买
（2）Marker 购买
（3）4×SDS上样缓冲溶液 可购买
1.0mol/L Tris·HCl（PH 6.8） 10ml
SDS 4g
甘油 20ml
DTT 3.12g
溴酚蓝 0.04g
双蒸水至 50ml
（4）5×蛋白电泳液缓冲液（用时稀释成1×）
Tris（MW121.14） 7.55g
甘氨酸（MW75.07） 188g
SDS 2.5g
双蒸水 100ml（定容至500ml）
先加100ml双蒸水，磁力搅拌至完全溶解，定容至500ml，室温保存。外槽电泳液可反复使用3次。
（5）10×蛋白电泳转移缓冲液（湿转）（用时稀释成1×）
Tris（MW121.14） 7.5g
甘氨酸（MW75.07） 37.54g
双蒸水 200ml（定容至250ml）
磁力搅拌至完全溶解，加双蒸水至250ml；临用前加甲醇至终浓度20%（50mlA+350ml水+100ml甲醇），室温保存，此溶液可重复使用3～5次。
（6）G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250： 100mg
95％乙醇： 50ml
85%正磷酸： 100ml
双蒸水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。分装使用，-20°C保存。
（7）10×丽春红染液（用时稀释成1×）
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
双蒸水至 100ml
可反复使用3-5次。
（8）20％Tween20
Tween20 20ml
双蒸水至 100ml
混匀后4℃保存。
（9）10×TBS缓冲液（用时稀释成1×）
Tris 12.1g
NaCl 40g
双蒸水至 500ml
高压灭菌，室温保存。待配置TBST缓冲液使用。
（10）TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 500μl
10×TBS 50ml
双蒸水 450ml
混匀后即可使用，最好现配现用。
（11）0.01mol/L PBS缓冲液（PH 7.2）
KCl 0.2g
KH2PO4 0.2g
NaCl 8g
Na2HPO4 2.08g
双蒸水 1000ml
溶于800ml双蒸水中，用浓盐酸调整PH至7.2，再定容至1L，高温灭菌后，4℃保存。
（12）封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g
TBST 100ml
（13）5%BSA（牛血清白蛋白）
BSA 0.5g
TBST 10ml
（14）一抗 购买
（15）二抗 购买
（16）显影液（5×）
自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水） 22.5g
碳酸钠（无水） 33.75g
溴化钾 20.95g
双蒸水至 500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用双蒸水稀释至1×。
（17）定影液
自来水（50～60℃） 700ml （以下药品加到温水中）
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加双蒸水定容至1000ml，室温保存
2. 蛋白样本提取制备
2.1 细胞组织裂解
2.1.1细胞裂解
裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择

细胞裂解操作方法：
1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）。
2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask)。
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中。
4 4℃摇动30 min。
5 4℃离心 12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）。
6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。
2.1.2组织裂解
组织裂解操作方法：
1 取10-20mg组织，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解。
2 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 3 先加蛋白酶抑制剂，再加预冷裂解液，按照组织和裂解液配比（1mg：30μl）加
入，至最终蛋白浓度约为100/3mg/ml，置于冰浴上匀浆， 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎，裂解30min。（裂解液体积与组织样本量有适当比例，最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml)。
4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。（置于－20℃保存，可以保存半年）
2.2 蛋白定量
2.2.1 BCA法测定方法如下:
A．酶标板操作
1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA 工作液，充分混匀；
3. 标准各管中加入1000μL BCA工作液；各管充分混匀；稀释待测样品至合适浓度（1:20），样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀；
4. 取70μL 各标准液和样品液到96孔板中，设置3个重复，37℃避光放置30分钟（孵育结束后可见颜色变化），然后在562nm下比色测定。以标准曲线0号管做参比，在562nm 波长下比色，记录吸光值；以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
B．分光光度计测定
1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂：

2. 根据样品数量，按50 体积BCA 试剂A 加1 体积BCA 试剂B（50:1）配制适量BCA 工作液，充分混匀；
3. 各管加入1000μL BCA 工作液；
4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线（R>0.99）；
5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA 工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30 分钟后，以标准曲线0 号管做参比，在562nm 波长下比色，记录吸光值；
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
2.2.2 其它方法
Bradford 法 Lowry 法或BCA 法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方法或产品比较列表如下：

3. 电泳
3.1 PAGE胶的制备（可以存放在4℃，第二天使用）
1. 清洗玻璃板 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。或者用电吹风吹干，干燥箱烤干。
2. 配胶与灌胶
① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）
② 按前面方法配8%或10％分离胶，加入TEMED后立即充分摇匀即迅速灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板左顶端流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
③ 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，大概30min。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
④ 按前面方法配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即充分摇匀即迅速灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，大概30min,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
3.2 上样
① 测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS。（15孔上样总体积一般为20ml，加样孔的最大限度可加40ml样品。）混匀器混匀后，将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。（剩余样品-20℃保存备用）
② marker试剂配平，上样量为3μl+（17μl 1×SDS上样缓冲液）。
③ 内槽电泳液需要加满，外槽电泳液加至一般高度；如果内槽电泳液漏液，则需把外槽电泳液加至稍低于内槽液面。（内槽电泳液只能用一次，外槽电泳液可使用3-5次，内槽电泳液用完可倒置外槽）
④电泳液加完后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。如有空置的加样孔，再邻近的加样孔中须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散，出现微笑条带。）
3.3 电泳
① 恒压跑法 恒压60V跑2h；或80V约30min跑上层浓缩胶，恒压120V约60min跑下层分离胶；
② 恒流跑法 恒流40mA跑70-90min
当染料从浓缩胶到分离胶时改变电压，当染料到达胶的底部，关电源停止电泳，取出硝酸纤维素薄膜并剪去左上角以标示正反面，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表），原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

PAGE 浓缩胶（5% Acrylamide）配方表

SDS-PAGE 分离胶配方表

4. 转膜
4.1 胶中蛋白的检测
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。
铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3 M CuCl2 染色5-10 分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。
考马斯蓝法：用40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
4.2 蛋白转膜
4.2.1 转膜方法
A．半干式转膜：
恒流转法：（30-100KD，1.2 mA/cm2，1h；）
恒压转法：（17KD，10V，1h；70-90KD，15V，18min；）
① 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
② 膜处理：预先裁好比胶条稍小的whatman,3mm滤纸、稍大的PVDF膜；PVDF膜先泡入无水甲醇中，约1-2 分钟，再浸于去离子水中3min；滤纸、膜全部浸入转膜缓冲液中10min。（胶和膜略大于滤纸，切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。）（NC膜不需要泡甲醇）（有定性定量滤纸，还有专门做转印的海面滤纸，如BIO-RAD）
③ 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去,要避免把分离胶刮破。
④ 转膜：在白色垫子上垫两层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒撤去其中的气泡；再把PVDF膜铺上，膜的正面朝上与胶接触。小心剥下分离胶盖于膜上，用手调整使其与膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。在胶上盖2张滤纸并除去气泡。整个操作在转移液中进行，要不断的撤去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路；
⑤ 将夹子放入转移槽中，将转膜装置与电源连接，电压25V，转膜15-30min。（电压和时间根据蛋白KD来调整）
⑥ 电转三明治顺序：
-极（黑色盖子）
滤纸2张（小）
PAGE胶（-极）
PVDF膜（+极）正面与胶接触
滤纸2张（大）
+极（白色底板）
电流1-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小，胶浓度，选择转移时间。

B. 湿式转膜（280mA，2h）
三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。

蛋白因结合SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。
4.2.2 膜的选择
两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF 膜（正电荷尼龙膜，聚偏二氟乙烯膜），根据不同需要选择（下表），PVDF 膜需要浸泡无水甲醇中1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。PVDF膜非常适合于低分子量蛋白的检测。
NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中）。
PVDF膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入无水甲醇中，约1-2 分钟。

4.2.3大蛋白和小蛋白的转膜注意事项：
电转移缓冲液中SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：
大蛋白（大于100 KD）：
1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF 需用甲醇活化。
5 选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜。
小蛋白（小于100 KD）：
1 SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。
2 保持20%的甲醇浓度。
4.3 膜上蛋白的检测
丽春红染色方法：
① 将膜放入TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中。
② 根据预染标准marker蛋白分子量指示，蛋白印迹清晰时，剪取目的条带（切去PVDF膜的左上角，以标记），再用TBST清洗，摇晃至条带无色，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存。（方便在剪取目的条带时剪偏方向）
4.4 膜的封闭
A. 封闭方法
将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。（为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。）
B. 封闭剂
传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA（牛血清白蛋白 ），脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。某些抗体用BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
4.5 一抗的孵育
一抗孵育方法：
1. 在1.5ml离心管中,将一抗用5%BSA稀释至适当浓度(1μl：1000μl)；
2. 从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，放于自制的孵育袋中，赶出残留气泡，
加入一抗1-2ml（体积根据膜大小而定），室温下在摇床上孵育2h，或4℃过夜；用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5-10min。

孵育缓冲溶液：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST 稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18 小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4℃ 进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
4.6 二抗的孵育
二抗孵育方法：
同上方法二抗用PBS稀释至适当浓度(1μl:10000μl:)并与膜接触，放入培养皿中室
温下在摇床上孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5-10min。

孵育缓冲溶液：用TBST 按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。亦可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。
孵育时间和温度：室温、1-2 hours, 摇动
二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP 碱性磷酸酶，因其不够灵敏。
5. 显色
显色方法：
① 将A和B两种试剂(荧光发光液)在保鲜膜上1:1混合；1min后，将膜蛋白面朝下
与此混合液充分接触；1min后，观察颜色反应，一旦特异性蛋白带颜色深度达到要求，即用去离子水漂洗终止颜色反应，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，避免产生褶皱或气泡。放入X-光片夹中。
② 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，
用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm），左下角剪角标记；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上（注意蛋白膜始终在保鲜膜内，不直接与X光片接触），一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（有条带即可）（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，在清水中过一遍，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
③ 凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统Bandscan软件分析目标带的分子量和净光密度值。将各目的条带灰度值除以同一标本内参照a-tubulin条带灰度值得到一比值，将该比值除以同一胶片上正常对照组的比值作为该目的蛋白质表达量的半定量结果。

X-ray 胶片：传统上使用手工曝光的方法，可控制X-ray 胶片在曝光和在定影剂的时间调节。而全自动X-ray 胶片曝光器也广泛使用并操作简便。
注意不能过度曝光，特别不适于检测相对蛋白量，过度曝光导致全暗的背景没有反差和/或产生大量的非特异性条带。
数字图像显影：新一代的胶片显色方法是使用数码相机在暗室中拍摄膜上的化学发光，将其转成数字信号，再通过仪器自带的软件进行分析。 有些新一代商品化的数字成像仪器已不再检测HRP连接的抗体（如：ECL chemiluminescence），如STORM分析仪只检测荧光标记的抗体。

显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法
酶促底物发光法代表为DAB 显色法，与其它同类方法的比较如下图所示：

而现在最常用的是化学发光法：HRP化学发光底物 Luminol（ECL法chemiluminescence）及其改良法，对于HRP偶联的二抗，一般传统上使用ECL和ECL+，推荐使用后者，更灵敏。其中不同商家的产品特点总结如下表：