酶工程-细胞工程产酶.pptx
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1、第三章第三章 动、植物细胞培养产酶、动、植物细胞培养产酶、有用次生代谢产物有用次生代谢产物第一节 植物细胞培养产酶第二节 动物细胞培养产酶初级代谢和次级代谢n 次级代谢是相对于初级代谢而言的,所谓初级代谢是一类普遍存在于生物中的代谢类型,是与生物生存有关的,涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。n 初级代谢产物如单糖、核苷酸、脂肪酸等单体,以及由它们组成的各种大分子聚合物如蛋白质、核酸、多糖、脂类等,都是有机体生存必不可少的物质。n 在这些物质的合成中的任何环节发生障碍,有可能引起生长停止,甚至导致机体发生突变或死亡。n 次级代谢是某些微生物为了避免代谢过程中,某种代谢产物的积累造成的不利作用,而
2、产生的一类有利于生存的代谢类型,通常是在生长后期合成。n 通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物。n 这些代谢产物并不是微生物生长所必需的,即使在这些代谢的某个环节上发生障碍,也不会导致机体生长停止或死亡,仅仅是影响了机体合成次级代谢产物的能力。通常它们以多组分的形式存在。n n 有学者认为这是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存方式,或是一种解毒方式,对产生菌的生存仍可能有一定的价值。n 次级代谢产物的种类很多,如氨基糖衍生物、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酰、萘、核苷、肽、喹啉、吡咯、吩嗪、多烯、聚乙炔、萜烯、四环类抗生素等。n 有的次级代谢产物含
3、有特殊的化学键,例如,-内酰胺环、有修饰过的氨基酸组成的环肽、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内脂类大环等。n 初级代谢与次级代谢除了以上不同外,还有许多区别:n 与微生物生长的相互关系上有明显不同,n 初级代谢过程自始至终都存在于一切生活细胞之中,并与机体的生长过程呈平行关系;n 而次级代谢则仅在机体生长的某一个时期产生,或在微生物的对数生长期后期或在稳定期,与微生物的生长不呈平行关系。n 初级代谢产物在不同的微生物中基本相同,n 而次级代谢产物的种类在不同微生物中是非常不同的。n 初级代谢对环境变化的敏感性比较小,即遗传稳定性强,n 而次级代谢对环境条件的变化很敏感,其产物的合成往往会因环境条
4、件的变化而停止。n 催化初级代谢产物合成的酶专一性强,n 而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。n 初级代谢和次级代谢类型既有区别,又是紧密联系着的。第一节 植物细胞培养产酶一、植物细胞的特性二、植物细胞培养的特点三、植物细胞培养的工艺条件及其控制四、植物细胞培养产酶的工艺过程n 动植物细胞培养是通过特定技术获得优良的动、植物细胞,然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养,以获得所需产物的过程。n 植物细胞培养的主要目的是生产色素、药物、香精、酶等次级代谢物。n 动物细胞培养的主要目的是获得疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质。细胞培养的定义细胞培养的定
5、义及生产目的及生产目的第一节第一节 植物细胞培养产酶和有用次生代谢产物植物细胞培养产酶和有用次生代谢产物n 人类从天然植物中提取各种有重要应用价值的产物受到了限制:一是天然植物的产量低,不能满足需要;二是许多野生植物正趋于濒危;三是引种驯化困难;四是受自然环境和耕地的影响,栽培中产量和质量难以控制。此外,用化学合成的方法,因为工艺复杂、成本高、污染大,也受到了限制。为此,发展植物细胞培养技术,生产各种来源于植物为此,发展植物细胞培养技术,生产各种来源于植物的有重要应用价值的产物。的有重要应用价值的产物。n 1902年德国植物生理学家哈勃兰德(Haberlandt)首次提出分离植物单细胞并将其培
6、养成植株的设想,并首次提出细胞培养的概念。n 这一论述的依据就是植物细胞全能性学说(cell totipotency)。n 所谓细胞的全能性(totipotency)是指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜力。n 1965年,由Vasil和Hildebrandt用单个分离的细胞培养成一个完整植株,细胞全能性得到实现。n 在这一理论的指导下,经过一个世纪的发展,植物细胞培养已经建立起专门技术,形成新的学科。n一、植物细胞的特性n (1)植物细胞比微生物细胞大得多,体积比微生物细胞大103-106倍;植物细胞的体积也比动物细胞大。n (2)植物细胞的生长速率和代谢速
7、率比微生物低,生长倍增时间较微生物长;生产周期也比微生物长。n (3)植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。n (4)植物细胞与动物细胞、微生物细胞的主要不同点之一,是大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间。n (5)植物细胞与动物细胞一样,对剪切力敏感。n (6)植物细胞和微生物、动物细胞用于生产的主要目的产物各不相同。植物细胞主要用于生产色素、药物、香精和酶等次级代谢物;微生物主要用于生产醇类、有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素和酶等;动物细胞主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子和酶等功能蛋白质。二、植物细胞培养的特点n 植物细胞培养技术首先从植物外植体
8、中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得优良的植物细胞。然后,在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而获得各种所需的产物。n 外植体(explant):在组织培养中,由植物体上取下来进行离体培养的那部分组织或器官。n 植物细胞培养生产各种天然产物,与从植物中提取分离这些物质相比,具有如下显著特点:n1.提高产率n 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物,可以明显提高天然产物的产率。n2.缩短周期n 植物细胞生长的倍增时间一般为12-16h,一般生产周期为15-30天,这比起微生物来是相当长的时间,但是与完整植物的生长周期比较,却是大大地缩短了生产周
9、期。n3.易于管理,减轻劳动强度n 植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产,不受地理环境和气候条件等的影响,易于操作管理,大大减轻劳动强度,改善了劳动条件。n4.提高产品质量n 植物细胞培养的主要产物的产率较高,杂质较少,在严格控制条件的生物反应器中生产,可以减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀,产物易于分离纯化,从而提高产品质量。n5.其他n 对剪切力敏感、生产周期长(缺点)n生长和代谢需要一定的光照。三、植物细胞培养的工艺条件及其控制(一)植物细胞培养的工艺流程外植体细胞的获取细胞培养分离纯化 产物1.外植体的选择与处理 外植体是指从植株中取出,经过预处理后,用于植物组
10、织和细胞培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等)片段或小块。外植体要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株。将外植体切成0.5-1cm左右的片段或小块,用70%-75%的乙醇溶液或者5%次氯酸钠、10%漂白粉、0.1%升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗,以除去残留的消毒剂。2.植物细胞的获取从外植体获取植物细胞的方法主要有直接分离法愈伤组织诱导法原生质体再生法(1)直接分离法机械法(捣碎外植体,过滤、离心分离)酶解法(酶处理外植体分离有活性细胞)植物细胞可以直接从外植体中分离得到。n(2)愈伤组织诱导法n 愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。n 通
11、过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程如下:n 将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入0.70.8的琼脂,制成半固体的愈伤组织诱导培养基。n 灭菌、冷却后,将外植体植入诱导培养基中,于25左右培养一段时间,即从外植体的切口部位长出小细胞团,此细胞团称之为愈伤组织。n 一般培养13周后,将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养,以获得更多的愈伤组织。n 诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割得到植物小细胞团,n 也可以在无菌条件下,将愈伤组织转移到液体培养基中,加入经过杀菌处理的玻璃珠,进行振荡培养,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞,n 然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤,除
12、去大细胞团和残渣,得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。n(3)原生质体再生法n 原生质体(protoplast)是除去细胞壁后得到的微球体。n 植物原生质体可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。n 植物原生质体的分离方法一般有机械分离法和酶解法两种,目前一般都采用酶解法分离原生质体。n 植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。n 为使细胞壁降解释放原生质体,必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂,最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。n 在原生质体制备过程中,为了防止原生质体被破坏,一般要采用高渗溶液,以利于完整原生质体的释放。n 配制高渗溶液的溶
13、质称为渗透压稳定剂。n 常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。n 原生质体分离后,经过计数和适当稀释,在一定条件下进行原生质体培养,使细胞壁再生,而形成单细胞悬浮液。n 细胞壁再生后得到的植物单细胞,经过单细胞培养,长成细胞团,再经过继代培养,形成由原生质体形成的细胞系。n3.细胞悬浮培养n 将上述获得的植物细胞在无菌条件下,转入新的液体培养基,在人工控制条件的生物反应器中,进行细胞悬浮培养,获得所需的产物。n4.分离纯化n 细胞培养完成后,分离收集细胞或者培养液,再采用各种生化技术,从细胞或者培养液中将各种物质分离,得到所需的产物。(二)植物细胞培养的培养基1.植物细胞培
14、养基的特点 植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别,其主要不同点在于:(1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐(2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素(3)植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 即可以同化硝酸盐和铵盐。(4)植物细胞一般以蔗糖为碳源 蔗糖的浓度一般为2%-5%。2.几种常见的植物细胞培养基(1)MS培养基 为培养烟草细胞而设计。其营养成分的种类和比例较为适宜。无机盐浓度较高,硝酸盐、钾和铵盐的含量比其它培养基高。应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。n(2)B5培养基n 为大豆细胞培养而设计的培养基。n 其主要特点是铵的含量较低。n 在豆科植物
15、上应用最多。(3)White培养基n 为番茄根尖培养而设计的培养基。n 该培养基成分比较简单,无机盐和糖的浓度较低。n 适用于生根培养。n(4)KM-8P培养基n 为原生质体培养而设计的培养基。n 其特点是有机成分的种类较全面,包括多种单糖、维生素和有机酸。n 在原生质体培养中广泛应用。n3.植物细胞培养基的配制n(一)母液的配制n 对于经常使用的培养基,为了减少每次配制培养基时称取试剂的麻烦,同时为了减少微量试剂在称量时造成的误差,可先将各种药品配制成10倍或100倍浓度的母液,放入冰箱内保存,用时再按比例稀释。n 母液分大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质(植物激素)。n 配制各
16、种母液时,药品称量要十分精确。n 配制母液一般用蒸馏水或无离子水,使水中不含或少含某些矿质离子。n(1)大量元素母液:以原用量的10倍配制(1050倍),依次溶解,混合定容1000ml。n(2)微量元素母液:一般配制100倍,定容1000ml,称量时最好用万分之一的电子天平。(3)铁盐母液:配制成100倍浓度,硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)一般比原用药量扩大100倍,分别溶解后,混合后再螯合30分钟,最后定容1000ml。(4)有机营养母液:是各种维生素和某些氨基酸的混合液。比原用量扩大100倍,定容1000ml。n(5)生长调节物质(植物激素)母液:配制要求更为严格。各种植物激
17、素分别配制成母液,一般浓度为0.51mg/ml。由于大多数植物激素难溶于水,需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中,再加水定容到一定的浓度。n 它们的配制方法如下:n生长素类:IAA(吲哚乙酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)为有机酸,制备时用碱液溶解。如一般称25mg IAA,加0.1mol/L NaOH 23ml,溶解后,加水定容25ml,即为IAA 1mg/ml,也可用无水乙醇溶解后定容。n细胞分裂素类:KT(激动素)、BA(苄基腺嘌呤)等,一般用0.1mol/L HCl溶解后加水定容。配制母液注意:配制母液注意:n 配制倍数不宜过高,这样一方面可避
18、免一时用不完造成的浪费,另一方面也可避免倍数过高,吸取量相对少而影响准确性。母液配制好后应放在24冰箱内保存。母液贮备时间不宜过长,尽量作到有计划配制,预期用完为宜。过长时宜出现沉淀和微生物污染。特别是有机物,应存放在冷冻室内较好。n(三)温度的控制n 一般控制在室温范围。n 不能低于20摄氏度,也不高于35摄氏度。n(四)pH值的控制n 微酸性范围。n pH5.0-6.0。n(五)溶解氧的调节控制n 通过通风和搅拌来供给。n(六)光照的控制n 根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同,进行光照的调节控制。前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。(七)前体的添加 为了提高植物细胞培养生
19、产次级代谢物的产量,在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。n(八)刺激物的应用n 刺激剂(elecitor)可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行,从而强化次级代谢物的生物合成,提高某些次级代谢物的产率。四、植物细胞培养产酶的工艺过程 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例,说明其工艺过程。nSOD的发现和发展现况n 超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶,它催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应,从而清除O2-。n 2O2-+2H+SOD H2O2+O2n 自从Mann 和Keilin 于1938 年首次从牛红血球中分离出一
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