药物筛选药物筛选方法学概论药物筛选概况一.doc

第二篇 药物筛选第五章 药物筛选方法学概论第一节 药物筛选概况一、药物筛选定义药物筛选：是对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和试验，以求发现其药用价值和临床用途，为新药研究和开发提供最初始的依据和资料。成功的筛选能够缩短创新药物研究与开发的周期、降低成本、减少风险和提高效率。虽然偶然发现的药物在药物研究中具有一定的作用，但过程是不可控的，因而不可能成为发现药物的主要途径。新药的发现，必须依赖主动寻找的过程，或称为广义的药物筛选过程。二、药物筛选形式（一）定向筛选即采用特定的方法，专门筛选防治某种疾病的药物。这种方法是现代医学研究过程中长期使用的方法，并在药学研究中取得了巨大的成就，如治疗心血管疾病的药物、抗肿瘤药物等。定向筛选对于发现某一类型的药物行之有效，但对于被筛选的物质来讲，却不能全面反映出内在的作用，因此理想的方法是在定向筛选的同时能够实现一药多筛，从多方面发现这些物质的作用。（二）对特定样品的筛选其特点在于利用已有信息，在特定的样品范围内进行筛选。例如抗生素类药物的筛选，筛选多种细菌产物的抗菌活性，从而发现了大量新的抗生素。对中药的研究也是采取这种方法，根据中药已有的相关信息，筛选特定中药的有效成分。这种方式具有较高的成功率，但被筛选的范围受到限制，忽略了广泛的资源，样品间对比的范围较小，易造成对低效样品的高投入研究，特别是信息资料不可靠时可能产生误导。（三）比较筛选根据对现有药物的认识，以确定的模型进行筛选，由此发现同类型而作用更好的新药物，其中包括“metoo”药。可利用的药物信息包括药物作用机制、药物代谢过程以及病理机制等。例如根据甾体激素类药物的结构，找到了大量抗炎药物；根据阿片类镇痛作用原理，发现了新的镇痛药物等。（四）随机筛选是对可能作为药用的样品进行药理活性的广泛筛选。这种筛选方法是新药发现的最基本方式，也是在医药发展过程中人们一直进行的方式。特点是能够发现全新的药物，但成功率不可预测。要保证药物随机筛选的成功率，就必须有足够的被筛选样品量和广泛的药物作用筛选方法。（五）计算机筛选计算机筛选实际上是根据药理学、药物化学、计算机科学等多学科的知识和理论，应用计算机和相关软件作为工具进行的化合物活性预测，最常用的方法是建立在药物与作用靶点相结合的理论基础上，采用计算机模型进行对接的方法选择具有可能相互作用的化合物结构。（六）高通量筛选高通量筛选是20世纪末发展起来的药物筛选新技术体系，已经成为主动寻找药物的重要技术手段，受到药物研究和开发者的极大重视。三、发展历程从神农尝百草到动物试验，再到现代药物筛选，人类在认识药物过程中，从无意识的偶然发现到主动筛选，历时千年，近代科学技术的发展，使药物发现进入了空前繁荣时代，药物筛选作为现代药物研究开发的重要内容仅有几十年的历史，但药物发现数量却超过了以往的总和。神农尝百草使人类从无意识自然药物发现，发展到有意识的主动药物发现历程，实现了人类药物研究的第一次飞跃。实验动物的应用，使人类药物研究产生了又一次飞跃。人类靠自身试验进行药物筛选，受到多种因素的限制，特别是不良反应，用人体筛选药物风险巨大。因此，使用动物进行药物筛选被人们所采用，古代文献中就有用动物进行药物毒性观察的大量记载。但人类有目的、有计划地应用动物进行药物筛选，是现代医学发展的结果。直到20世纪70年代中期，动物试验一直是药物筛选的基本方法。但由于动物试验需要时间长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大（约5g）等因素的限制，因而发展缓慢，未能进行大规模筛选。现代药物筛选，使人类药物研究进入了高速发展的繁荣时代。现代科学发展为高效率地进行药物筛选提供技术条件。20世纪70年代中期，同位素标记方法的建立，特别是邻近闪烁分析法（Scintillation Proximity Assay，SPA）的应用，使药物筛选技术有了极大提高。为了避免同位素筛选带来的环境放射性污染，近年又发展了用于高通量筛选的紫外，荧光和发光检测法。20世纪80年代中期，实验室自动化工作站的应用，使药物筛选工作的工作强度、实验成本和样品需要量降低（10mg）。随着对药物作用机制的深入认识，酶和受体与疾病的关系不断阐明，为建立高特异性的筛选模型奠定了基础，促使药物筛选由整体动物试验为主转变为体外试验为主，形成了高通量药物筛选（HTS， High Throughput Screening）模式，使大规模高效率的药物筛选工作在世界范围内广泛开展起来。四、药物筛选模型分类及研究进展（一）整体动物模型及进展在药物的研究中，传统的动物模型仍然是重要的评价依据。单纯从新药筛选的角度看，整体动物模型的最大优点是可以从整体水平客观反映药物的治疗作用、不良反应等。从整体实验中获得的筛选结果，对预测样品的临床价值和应用前景十分重要。但整体动物的特点决定了药物筛选的过程主要依赖于手工操作，样品需要量大，只能对有限样品进行筛选，在效率与成本方面有明显不足。这一领域的研究进展主要表现在制备人类疾病动物模型方面。出现了一些新的动物模型：遗传性动物模型，如高血压大鼠、糖尿病大鼠、小鼠、肥胖型小鼠、心肌病大鼠等；转基因动物模型，如老年痴呆、红斑狼疮等；异体移植肿瘤小鼠模型等。（二）组织器官水平的筛选模型及进展现代医学和现代药理学的发展，采用动物的组织、器官制备的药物筛选模型越来越多，如离体血管实验、离体心脏灌流实验、组织培养实验等。通过观察药物对组织或器官的作用，分析药物作用及作用机制。组织、器官水平的筛选模型可以反映生理条件下的药物作用，也可以制备成病理模型，这一筛选方式在一定程度上弥补了整体动物模型的不足：第一减少了样品需求量。一般整体动物对样品的需求量约为15g，组织、器官水平的离体筛选约为整体的1/10；第二，降低了劳动强度、研究成本，提高了筛选效率；第三，减少影响药物作用的因素，有利于药物作用机制的研究。尽管目前药物筛选模型集中在分子细胞水平和转基因动物方面，近年来组织器官水平的筛选模型也取得了很大的进步，主要进展为测定方法的改进和结果处理自动化。（三）细胞、微生物水平的筛选模型及进展细胞水平的筛选模型可以应用到各种人类疾病的研究和治疗药物的筛选中，由于细胞的生长条件和来源较实验动物更经济方便，细胞水平的筛选模型可以进行大规模药物筛选，是高通量药物筛选的重要研究领域。这一水平的筛选模型是通过体外培养的方式，观察样品对细胞或微生物的作用，获得可能作为药品进一步研究的信息。与组织器官水平筛选模型相比：第一，扩大了筛选谱，目前筛选细胞模型包括：正常细胞如脑细胞、心肌细胞等，病理细胞如肿瘤细胞等，基因敲出细胞、病毒感染细胞等。微生物模型包括细菌、真菌等；第二，弥补了离体组织器官体外活力保存时间不长、可供研究的目标疾病谱过少的不足，且操作更简便，易于实现自动化。细胞水平筛选模型的最大优势是能够反映内外环境综合因素引起的整个细胞变化，更易于评价药物的作用和药用价值，其不足之处在于不能像分子水平筛选模型那样准备地反映药物作用的机制。随着生命科学和生物工程技术的迅猛发展，生物膜技术不断成熟并进入药物筛选领域。若将活性组织细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相，用液相色谱的方法研究药物和化合物与固定相上细胞膜及膜受体的相互作用则构成细胞膜色谱法。细胞生物学的发展使更多的细胞可用于筛选，除正常细胞外，转基因细胞、基因敲出细胞、病理细胞更多的被用于药物筛选。例如，可用RNAi技术制备P53基因缺失肿瘤细胞，用于抗肿瘤药物筛选及机制研究。（四）生化水平的筛选模型进展如建立体外氧自由生成体系，观察样品对氧自由基的清除能力，获得潜在的可保护细胞损伤的药物；建立体外非酶糖基化生成体系，观察样品对非酶糖基化的抑制作用，获得潜在的抗糖尿病并发症药物。这一筛选模型的优点是，药物作用机制明确，筛选效率高。（五）分子水平的筛选模型及进展以酶、受体、离子通道及基因表达调控为靶点，观察样品的作用，属于分子筛选模型。这一模型最大的优点是，作用机制明确、操作简单、检测灵敏度高、等，可实现规模化筛选。但筛得的化合物在后续药物评价中，被淘汰的概率大，所以仅靠分子水平模型评价药物作用，也存在明显不足。分子水平药物筛选进展表现为以下新技术的研究进展：1受体技术的进展受体学说的阐明，为药物筛选提供了可靠的方法，利用放射性结合法，可在一天之内得到数百个样品的筛选结果，也可以获得同一个样品对不同受体的结合力资料。尤其是人类基因组计划的实施，新的受体及其亚型被不断发现，国际上一些大制药公司竞相开展以纯化受体、克隆受体、重组受体为目标靶点的药物筛选工作。重组受体是近年来发展起来的一项技术，与传统的制备方法相比，用重组受体技术制备的受体具有纯度高、制备量大、成本低、试验结果与人体试验的结果直接相关等优点。依据目前已得到的人类基因组信息，越来越多的与疾病相关的特异受体亚型被识别和克隆，成为作用更专一的药物作用靶点。但纯化受体、克隆受体虽然实现了受体与配体特异性结合，却破坏了受体发挥生物活性的周围环境，而且受体类型单一。事实上，除少数疾病的发病原因与单一靶点有密切关系外，多数疾病都与多靶点有关系。2生物芯片技术进展生物芯片技术是近来发展的新技术，是分子生物学与微电子技术相结合的DNA分析检测技术，能在微小的芯片上获得大量生物活性数据。基因是遗传信息的载体，药物通过不同的作用靶点作用于组织细胞，直接或间接地影响细胞内基因表达。基因水平的药物筛选模型，可以从更深入的层次评价药物的作用，从而为许多疑难病症提供新的治疗途径和方法，是新药筛选方法上的革命，其特点是高通量、微型化和自动化。目前，国外几乎所有大公司都不同程度地采用了生物芯片技术。应用生物芯片寻找药物靶标，考察药物的毒副作用，具有广阔的应用前景。用于药物筛选的基因芯片主要是DNA Microarray表达谱基因芯片，通过对用药前后两组样品进行表达谱基因芯片检测，就可以反映出该药物作用后相应组织或细胞中基因表达谱的变化，从而揭示药物作用的靶基因。利用基因芯片进行药物筛选，可以省略大量的动物试验，能够大大缩短药物筛选的时间和成本。基因芯片技术虽有诸多优点，但要成为实验室或临床可以普遍采用的技术目前尚有一些关键问题亟待解决。如何提高芯片的特异性，简化样本制备和标记操作程序，增加信号检测的灵敏度和高度集成化样本的制备，基因扩增，核酸标记及检测仪器。3生物信息学在药物筛选中的应用生物信息学技术在药物筛选中的应用不仅在于发展新的药物作用靶点和建立新的筛选模型，而且在筛选结果的分析、药物作用的评价以及药物作用机制的研究等方面，都显示出明显的优势。生物信息学可以通过对基因和蛋白质的研究，提供更多的信息，使分析结果更符合实际，随着高通量药物筛选技术的发展和芯片技术的应用，更需要生物信息学技术的参与和支持。在进行药物靶点研究的同时，应用生物信息学技术和计算机辅助设计技术相结合，开辟了新的药物发现途径。在生物信息学研究的基础上，利用获得的蛋白质结构和功能信息，用计算机模拟的方式直接进行药物筛选，加快了药物发现的速度。此外，应用生物信息学技术可研究个体之间基因表达差异、预测药物的体内过程、分析药物不良反应相关的基因因素，达到预测药物不良反应的目的。第二节 药物筛选与新药发现的基本过程反向药理学（Reverse Pharmacology）是相对于传统药理学研究过程，提出的新的研究思路，是对高通量药物筛选引发的研究过程的概括。反向药理学的最大特点是从药物作用机制开始，研究药物作用的特点和规律。真正促进反向药理学发展的基础是高通量药物筛选的广泛开展。由于高通量药物筛选多数是在分子水平的筛选模型上进行，故获得的药物作用信息是药物与作用靶点之间的关系，或者说是直接认识了药物作用机制。但无论所采用的药物作用靶点属于何种类型，仅根据药物与靶点之间关系，是不能说明药物的全部药理作用。因此，要在药物作用机制的引导下，进行全面的药理学研究，直至整体动物药效学研究。由于该过程与传统药理学研究的模式相反，故称为反向药理学。传统药理学研究方法对药物开发有两个重要的制约环节：一是发现新药。以药效学作为观察指标进行药物筛选，寻找新的药物。其突出的困难是效率低、规模小、成本高、难度大，因而不能形成规模，制约了新发展的速度；二是机制研究难度大，往往需要进行大量的探索工作。例如强心苷类药物，首先在临床上认识到该类药物具有强心作用，此后，药理学家对其进行了多方面的探讨和研究。经过几十年的努力，才证明了强心苷类药物的主要作用机制是通过抑制Na+K+ATP酶活性，从而增加心肌收缩力。目前临床应用的大多数药物，都经历了类似的研究过程，才真正发现和认识了它们的作用机制。反向药理学是人们进行药物研究的新模式。这种模式的最大优势是可以从药物作用的靶点水平，大规模地筛选药物，高效率地发现新药。利用药物作用靶点进行药物筛选，已成功地发现了大批临床用药。如：血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利、依那普利、赖诺普利等降血压药物，肾上腺素受体拮抗剂普萘洛尔、阿替洛尔等，都是利用分子靶点筛选而发现的药物，并经过进一步研究而成为临床应用的抗心律失常药。现代药物筛选方法发现和开发药物一般有如下几个步骤。一、初筛和复筛是在分子或细胞水平筛选样品，证明某一样品对该靶点具有药理活性（或亲和力）。初筛以后，选择具有活性的化合物，采用系列浓度，进行同一模型的复筛，阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此发现活性化合物（样品）。二、深入筛选在初筛和复筛的基础上，将得到的样品，采用与初筛不同但相关的分子、细胞膜型作进一步的筛选，包括证明样品的选择性、细胞毒性，以及其他性质。经过深入筛选，为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。根据这些资料，并结合活性价值的化合物，作为先导化合物。同时也可以结合组织器官或整体动物模型，证明其药理作用，为样品提供更加充分的试验依据。获得先导化合物以后，根据实际情况进行结构优化（根据资料也可以直接作为药物候选化合物进行开发），即进行化合物结构的改造，以便得到活性更高、不良反应更小的活性物质。三、确证筛选对深入筛选获得的先导化合物或优化后被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究，包括药理作用、药物代谢过程、一般不良反应等多方面的筛选，以确定其开发前景。将符合要求的样品确定为药物候选化合物，进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。尽管应用反向药理学研究模式已有成功的例子、发现了大量药物，但由于药物在机体内发挥作用过程的复杂性，特别是药物作用多靶点多因素的干扰，即使在体外具有良好活性的化合物，也并不一定在整体水平上表现出预期效果。因此，传统药理学在药物研究过程中仍承担重要的任务。第三节 高通量药物筛选高通量药物筛选是应用先进的实验方法和技术，对大量化合物进行微量样本的实验测定，尤其是应用计算机控制技术，实现筛选工作的自动化。在适当条件下，每天筛选量可达一万或数万样本次。为了减少动物用量和动物标本的制备量，应用分子生物学技术，使细胞拥有人受体基因，进行细胞受体分析，或通过细胞表达，或应用基因重组的方法，制备所需要的实验标本。由于高通量药物筛选需要大量新化合物，传统的化学合成方法已不能满足筛选的需要。组合化学（Combinatorial Chemistry）和组合化合物库（Combinatorial Library）的应用就是为了适应高通量药物筛选而发展起来的新兴领域。早期的组合化学只是进行肽类合成，获得大量新的肽类化合物。现已开始致力于普通有机分子的合成。理论上，组合化学每年可以提供数十万或更多的新化合物。一、高通量药物筛选的基本特点（一）充分利用药用资源由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药物质资源，提高了药物发现的几率，同时提高了发现新药的质量。（二）微量筛选系统由于高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型，样品用量一般在微克级（g），节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本。（三）高度自动化操作随着对高通量药物筛选的重视程度不断提高，用于高通量药物筛选操作设备和检测仪器都有了长足发展，实现了计算机控制的自动化，减少了操作误差的发生，提高了筛选效率和结果的准确性。（四）多学科理论和技术的结合在高通量筛选过程中，不仅应用了普通的药理学技术和理论，而且与药物化学、分子生物学、细胞生物学、数学、微生物学、计算机科学等多学科紧密结合。这种多学科的有机结合，在药物筛选领域产生大量新的课题和发展机会，促进了药物筛选理论和技术的发展。二、高通量药物筛选的理论基础（一）样品与靶点的相互作用药物的治疗作用，多数是由于药物与机体内生物大分子特定位点（靶点）相结合而产生的。药物与靶点相互作用，达到相互间的结合，根据分子间相互作用的原理建立筛选模型，可以筛选出与特定靶点具有亲和力的样品。如作用于受体的药物筛选，是根据受体配体相互作用的理论建立起来的筛选方法，通过筛选，可以发现能够与特定的受体相结合的化合物，并能评价其亲和力的大小。除受体以外，药物与其他生物大分子如酶的要互作用也符合这一规律。（二）对酶活性的影响在以酶抑制药为筛选目标进行筛选时，根据分子间相互作用原理筛选具有亲和力的化合物，也可以根据酶活性作为检测指标筛选影响酶活性的化合物。采用酶活性（观察反应底物的减少或产物的增加）作为观察指标，可直接说明药物的作用，这种筛选模型在高通量筛选中被广泛采用。（三）对细胞的作用以整体细胞作为药物作用的对象，观察被筛选样品对整体细胞的影响。这种作用方式可能是通过某一具体的靶点，也可能是作用于多靶点，其产生的效应是在整体细胞条件下获得的，可以反映整体细胞对药物作用的反应。三、高通量药物筛选的基本条件（一）化合物库高通量筛选药物还需要有数十万至上百万个化合物储备。由此可见，作为后基因组时代高通量筛选技术，单靠一个学科是无法开展的，大跨度的学科交叉势在必行。这涉及到医学及其各个分以学科，如分子生物学、化学、光学、自动化仪器、计算机等众多学科的大联合。（二）针对靶标的高通量筛选模型（Bioware）筛选疾病基因或其表达的蛋白，需要有完备的基因或蛋白库。（三）高通量药物筛选平台（Hardware）包括：检测指标：需要将检测指标转化为简便、灵敏、稳定的客观检测信号，如荧光、化学发光、放射性核素等；检测仪器：制作快速检测微量样本的仪器，保证高通量筛选的信息能够快速准确地读出；自动化取样和加样机器人：一次加样上千个微量样本，人工无法完成，因此研制自动化仪器同样是必不可少的条件。（四）数据的信息处理系统（Software）针对短时间获得的庞大的实验数据，必须要相应的计算机硬件和软件的支持。四、用于高通量药物筛选的生物材料有两大类，一类是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗体、酶、蛋白质等生物大分子，另一类是细胞。将生物大分子以高密度微阵列方式排列于玻璃板或膜片上，与生物样本反应，然后检测观察指标的变化，常称为芯片（chip）技术。以细胞为材料的研究方法，采取预先制备目的基因或报告基因的转染细胞株，然后观察目的基因或报告基因表达变化。五、高通量药物筛选技术药物高通量筛选技术，是将化学、基因组研究、生物信息，以及自动化仪器等先进技术，有机组合成一个高程序、高自动化的新模式，从而创造了发现新药的新程序。由于该技术具有快速、高效等特点，因而成为新药发现的主要手段。英国学者AlanD研究提示，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，1年内仅能筛选75000个样品；1997年高通量筛选技术发展初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品；1999年高通量筛选技术进一步完善后，每天的筛选量就高达10万种化合物。药物高通量筛选工作在我国起步较晚，且不规范。近年来，我国进行了外引内联的整体化、规模化基础建设，已初见成效。1996年中国医学科学院引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站；1998年又引进全国第一台Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。高通量筛选技术，是目前药物筛选领域研究的重要课题，近年来，对它的研究应用虽然已取得了长足的发展，但仍然存在许多难题，如体外模型的筛选结果与整体药理作用的关系；对高通量筛选模型的评价标准以及新的药物作用靶点的研究和发现等。随着医药学的进步，高通量筛选技术在创新药物的研发中，一定会开拓出更广阔的空间。六、高通量药物筛选模型（一）基于反酵母双杂交系统的药物筛选模型酵母反双杂交系统是从酵母双杂交系统发展而来的新型药物筛选系统。酵母双杂交系统已经成为研究蛋白-蛋白相互作用的一种成熟有效的遗传学方法。其理论依据是，许多序列特异性的转录因子通过结合到DNA上游激活序列（UAS）并在相应的启动子部位激活RNA聚合酶II而提高靶基因的转录效率。DNA结合和激活功能定位于2个互相分离的结构域内，分别称为DNA结合结构域（DNA Binding Domain，DBD）和DNA激活阈（Activated Domain，AD）。与转录因子无关的蛋白与蛋白间相互作用使得DBD和AD在空间上相互接近，从而重组形成一个有功能的转录因子。因此，有功能转录因子的重组可以总结为DB-X和AD-Y，其中的X、Y可以来自任何组织的蛋白质分子。将酵母生长标记例如LEU2或者HIS3（分别参与了亮氨酸和组氨酸的合成）置于含有DBD结合位点的启动子控制下，则DB-X与AD-Y的相互作用会产生选择性生长优势，从而在缺乏特定氨基酸的培养基上呈现小的菌落。据此可以确定大量蛋白间的相互作用。反酵母双杂交是基于酵母双杂交基础上的一种新型的药物筛选方法。其理论基础与酵母双杂交基本相似，区别在于其报告基因不同，反酵母双杂交系统中只有在蛋白间相互作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势。（二）基于细胞平台的药物筛选模型与酵母系统相比较，细胞平台的药物筛选系统可以直接选取来源于人源组织的细胞或者是人源转化细胞株进行培养，更接近人体的情况，因此能够改善一些蛋白靶点在异源细胞中表达情况不够理想的局面。基于细胞的高通量筛选能够提供化合物对于特定受体、离子通道或者是细胞内的药理活性，而传统的生化分析往往不能得到这些活性数据。例如细胞平台上的高通量筛选能够区别药物发挥的究竟是激动剂还是拮抗剂作用，或者是结构调节作用。同样，细胞平台的HTS也能够提供有关药物膜通透性以及毒性方面的信息。在各种刺激下，细胞能启动一系列的生理过程，例如基因转录、离子通道的开关、细胞增殖、细胞毒性、分泌、蛋白表达、酶活性改变等。这些性状的改变为检测提供了很好的目标。（三）基于动物平台的药物筛选模型基于反酵母双杂交的的高通量筛选模型和基于细胞平台的高通量筛选模型均为体外模型，而有些药物虽然在体外模型中能够显示很好活性，但进入动物体内检测时活性却大大降低，甚至无活性。这主要是由于在人体或者动物体内，药物作用的发挥除了必须具备药理活性以外，还与其吸收、分布、代谢、排泄（ADME）情况有关。有些药物虽然在体外具有很高的活性，但是由于脂水分配系数的问题，导致机体难以吸收，或者不能正确地分布到作用靶位点，故体内活性急剧降低。将动物体模型作为药物筛选模型是近年来刚刚发展起来的。由于动物体的完整性，解决了筛选药物的药理活性和对药物的ADME进行研究的问题。第四节 药物毒性筛选药物毒性是药物的一个至关重要的性质，也是最难以筛选的性质。药物毒性可能是种属特异性的或组织特异性的，也可能是多种其他因子共同作用的结果，有时需要长期服用才能体现。要在简单的体外模型中考虑到所有的影响因素是不太可能的，由于药物毒性大多体现在肝毒性，而且药物代谢会改变药物的毒性，因此经常使用分离的肝细胞衡量药物安全性和人服用中毒剂量等提供数据。在用于视觉中毒试验的模型中，有用于急性试验的人角化细胞和角膜上皮细胞的单层培养物，也有用于慢性试验的角膜上皮3D模型，还有人造的角膜。同样在皮肤模型中，包括角化细胞或纤维原细胞的单层培养物和人表皮的3D模型。肾毒性试验可用近球小管细包单层培养物也可使用新鲜分离的肾小球囊或肾单元进行，但它们的存活期只有几个小时，人的其他组织如肺、心、肠和淋巴都可用来进行毒性试验，不过大都只能进行细胞中毒试验。这些细胞毒性筛选模型基本都是将药物与细胞共同孵育一段时间，然后检测细胞的活性，或是检测一些其他指标。细胞活性可通过多种方法来检测，如基于线粒体活性的MTT法、中性红染色法、基于细胞膜完整的酶释放测量。其他测试指标还有对分化细胞DNA合成或所有种类细胞的RNA、蛋白事成检测，以及针对自由基毒性的GSH（谷胱甘肽）检测。许多其他的检测方法则要依赖于具体试验来确定。生物技术如芯片技术的发展，使得基因表达谱的建立变得很方便。基因表达的变化也许是人体毒理反应中最为敏感的标志。在常规临床前安全性检测中通常无法得到肝脏功能紊乱的分子依据，当临床上已经使用这种药物后才发现它对肝脏的副作用，而芯片技术能检测出常规方法不能检测到的毒性作用。一、肝细胞毒筛选体外细胞毒检测体系常选用培养的肝细胞，肝切片也被用于这种筛选实验。与培养的肝细胞相比，肝切片有更大的优越性，它更容易采用相同的技术从不同种系（包括人）中制备标本。人肝标本的应用对肝毒性的预测有较高的有效性，它克服了人与动物之间的差异，唯一的不足是标本的来源有限。新化学品的作用机制常常不明确，需要根据肝毒性特点选择体外模型。对于肝细胞坏死，常采用传统的模型如肝细胞培养和肝切片，以原始细胞毒和细胞死亡为终点，如酶漏出和染料排斥。更复杂的模型，如肝细胞联合培养模型以胆酸分泌为检测终点，用于药源性胆固醇沉积症的预测。二、基因突变检测由于现行新药临床前遗传毒性检测方法仅能从最终生物学效应对突变作用进行认定，还不能确定突变部位和类型，更不能从突变发生的根本机制上检测药物的致突作用，因此现行检测方法需要进一步深化和完善。对基因突变检测，常用分子生物学方法，包括单链构象多态性检测、异源双链核酸分子分析、蛋白截短试验、错配化学裂解法以及转换限制性酶切位点突变分析法，上述突变检测方法在新药临床前遗传毒性检测中有广阔的应用前景。DNA的一级结构决定其构象形态，而构象不同的单链DNA片段在非变性聚现衡酰胺凝胶电泳（PAGE）中的泳动速率不同，所以一旦DNA片段的碱基组成发生变化，就可在电泳中表现出来，这就是单链构象多态性分析检测DNA突变的原理，该方法以对较小DNA片段的突变检出率较高，尤其适合于200bp以内的靶DNA。异源双链核酸分子分析原理与单链构象多态性检测分析法相似，只是它分离的是双链，该方法对200300bp大小DNA的突变检测效果较好。蛋白截短试验是从蛋白质水平的变化来检测基因突变，它主要检测导致开放阅读框架改变的碱基缺失或插入突变等，本方法以的优点是突变检出率高，并可检测45kb片段的突变。错配化学裂解性法是由片段长度多态性和限制性位点突变分析方法基础上发展而来，可检测因突变致使原酶切位点转换为另一新的酶切位点的变化。三、共价结合分析大量实验证实药源性肝损伤与药物和肝内特殊蛋白结合相关。采用放射化学和免疫化学方法可以定量检测药物及其代谢产物与肝内蛋白的结合，免疫化学技术已用于检测一些药物毒性作用的靶蛋白。对乙酰氨基酚代谢产物选择性的与微粒体4244kd蛋白和胞浆5658kd蛋白结合，并引起细胞内关键性蛋白的烷基化导致细胞死亡。某些蛋白的烷基化已被证实可形成抗原从而诱发免疫介导的肝毒性。如果直接或免疫介导的肝毒性被确定与某些蛋白的共价结合有关，那么发展相关肝毒性预测模型将成为可能。四、基因组学和蛋白组学的应用基因组、蛋白质组以及组合化学被认为是21世纪的三大规模科学，它们共同的特点是从整体角度进行研究。蛋白质组和基因组互相补充，更有效和完整的解释各种生命现象。在大部分肝毒性发生时，直接或间接机制将引起基因及其表达产物的改变。毒理学家面临的问题是确定和证实基因的改变由毒素引起。基因组和蛋白组学方法使得快速检测基因改变成为可能，也使毒理学的基本检测方法得以建立。基因组学技术的核心是基因芯片的使用，其原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定。对于肝毒素，探针从药品处理过的肝细胞中制备，后经过微阵列杂交，空白组和处理组的肝细胞之间的微阵列差异说明药物引起的基因改变。用肝毒性机制明确的毒素，建立一种检测终点，对于活性未知的化合物可通过上述检测终点比较基因表达差异，以确定其肝毒性。蛋白质组是指不同时期细胞或组织内蛋白质的变化，如细胞用药或不用药之间蛋白质水平的差别。蛋白质从药物处理过的细胞或组织中提取，采用双向凝胶电泳和蛋白阵列等技术，通过比较蛋白质组谱的差异，毒物作用的特征可被确定。这样的系统可用于化学物肝毒性的筛选，或者像微阵列技术那样用于毒性机制的研究。化合物或其代谢产物与蛋白质的共价结合也可用这种方法加以识别。蛋白质作为毒性作用的终点将成为毒性预测的有力工具。这个领域正在迅速发展，一些公司正处在应用的初期阶段。临床前动物试验不能够为人群肝毒性提供完善的安全评价，临床前肝毒性检测的实验策略有待改进。在新药安全性评价中引入最新的分子生物学方法和技术是必要的。这些技术包括体外细胞毒筛选试验、基因突变检测、共价结合分析、毒理基因组学和蛋白基因组学等，它们在新药临床前肝毒性检测中有广阔的应用前景。五、常用检测方法（一）常规的细胞毒性检测方法以往体外细胞毒性终点检测方法主要有以下几种：化学染料法，用甲基紫或磺基罗丹明B（SulforhodamineB，SRB）染色法，染料可以吸附在细胞的特殊成分上，由此测量存活的细胞数，检测释放的细胞组成成分法，如乳酸脱氢酶。通过检测细胞培养上清液中酶的活性来反映细胞毒性，四氮唑盐法，如MTT、MTS和XTT法等。四氮唑盐可以被活细胞线粒体中存在与辅酶II（NADP）相关的脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色的Formazan；放射性同位素标记法，细胞经放射性同位素（如铬）标记后在细胞溶解时被释放。另外，还有DNA损伤可以通过微板法检测出来。这些检测方法对于潜在的致癌物检测和基因组毒性的研究是必不可少的。（二）新的细胞毒性检测方法以前用的一些方法由于是非自动化，且存在着提前接种和洗涤等步骤，操作不便。人们把目光集中到荧光或者是化学发光终点法上，这些方法使用简便，并且具有较高的灵敏度。1荧光染色法荧光染色法可应用于细胞毒性的检测上。活细胞的浆膜结构对染料具有排斥作用，加入具有细胞毒性的药物会使浆膜受到破坏，从而使染料易进入到细胞溶质中。高通量细胞毒性检测需要在微孔板上进行，并且接种和分析在同一块板上进行，流式细胞计数仪并不完全适合高通量细胞毒性检测的要求，所以荧光微板检测法逐渐发展起来。利用表达增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）可高通量检测细胞死亡。刃天青（Resazurin）是非荧光染料，在活细胞的培养液中，可由蓝色被还原为粉红色的荧光染料。在细胞培养中荧光染色可以使细胞仍然存活。虽然有人认为这种染色是通过线粒体酶诱导的，但是其真正的染色机制还有待于阐明。此染色法只需加入一种试剂到培养细胞的上清液中，细胞不被杀死，因而可以对同一样品进行其他检测。刃天青检测具有高度的灵敏度，一次最少可以检测80个细胞。刃天青可以与细胞共同培养，所以可以进行细胞毒性代谢动力学分析。2化学发光检测法化学发光是指物质在酶作用下，能量以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型发光及闪光型发光，辉光型化学发光的发光时间较长而且稳定；闪光型发光是以发光蛋白、三磷腺苷（ATP）、荧光素酶为底物的发光反应，其发光时间较短。化学发光由于应用了时间分辨及偶合回路技术，其检测灵敏度可以达到0.1pg数量级。在单孔多点喷射技术中，反应性底物通过光导纤维末端的喷头加入孔中混合均匀。发光反应启动后可立即进行测定，这对闪光型化学发光的测定有利。3生物发光检测法ATP生物发光检测法是由荧火虫荧光素酶提供的一个非常简单、高效、高灵敏度的检测法。生物体内（包括原核生物和真核生物）的ATP在能量转换中起非常重要的作用。因为所有的细胞需要ATP来维持生存，所以它可以作为估测细胞功能完整性的一个工具。与MTT法比较，ATP生物发光法主要的优点是它的灵敏性和可重复性。4荧光检测法新型的激发荧光检测的特点是用连续的激发光谱和测定光谱取代固定光谱，从而使建立的模型更具备灵活性，通过对96孔板和384孔板进行信号采集和处理，使之更适用于HTS。（三）细胞毒性终点的选择与毒理学相关的细胞毒性终点不超过20个，包括细胞吸附或迁移、凋亡、分裂、分化、坏死等。在目前的条件下要设计HTS方法以求能全面反映上述所有细胞毒性终点的确有一定困难。通过与小鼠急性试验的资料比较发展，细胞的生长抑制具有较好的毒性预测性，将其作为单一的细胞毒性终点可能适当，选择单一来源的细胞进行高通量细胞毒性筛选可以作为毒性的初筛，50%生长抑制浓度为10-610-8mol/L的化合物可以进一步进行研究。第五节 药物筛选数据分析一、样品活性评价筛选的目的是为了发现活性化合物，大规模筛选完成以后，获得的结果不可能达到这一目的，因为筛选的活性结果在大量的样品中是接近连续的，如何确定活性化合物进行下一步的工作，需要有一个标准进行判断和评价。一般使用的简单方法有以下三种：（一）阳性率法所谓阳性率法实际上就是人为地根据工作的经验和筛选工作的承受能力，确定一个样品化合物的比例，根据样品的活性，由高到低选取一定数量的样品作为活性样品，进入下一步的筛选程序。阳性率的确定主要考虑三个方面的因素：一是一般筛选的活性发现率，主要根据经验判断；二是筛选工作的承受能力，选择数量过大，将会增加下一轮的工作和筛选经费的投入，造成人力财力的浪费；三是实际活性分布情况，高活性样品多时比率可以定的高些，反之则低些。例如将阳性率人为地定为2%。如果筛选的样品量为8000个，那么就从活性最高的样品开始，选取160个样品作为活性样品，进行下一步工作程序。这种方法比较简单，易于操作，但是存在许多不合理因素，首先这种比例缺乏客观依据，不能准确反应筛选结果；其次，这样的选择有可能将活性低的样品选入，也有可能漏掉活性较好的样品。（二）活性指标法活性指标判断法和阳性率法基本相似，也是人为地根据活性划定活性样品的界限。其依据主要考虑是活性的分布和筛选承受能力。对于高活性样品较多的筛选结果，指标可以定的高一些，如将抑制率超过90%或95%的样品作活性样品进入下一轮筛选；而对于高活性样品较少的筛选结果，甚至可能将标准定为70%作为活性样品的指标。这种方法人为因素较大，缺少严格的客观依据，虽然具有可操作性。但在实际工作中操作起来会产生许多问题。（三）阳性药标准该方法具有客观的标准，易于操作，主要是根据选用的阳性药的性活结果作为最低界限，凡是活性超过阳性药的样品，全部定为活性样品进入下一轮筛选。这种方法看起来严格而且合理，并且可以认为由此筛选到的活性样品都优于阳性药物。事实上并非如此，首先，在实际筛选药物中，发现超过阳性药的可能性很大，有时会出现大量的样品超过阳性药，但这些样品未必就能发展成为有效药物；其次，在筛选的样品中有些虽然活性低于阳性药，但由于具有良好的品质或结构，经过改造以后可能是优秀的药物；第三，很多情况下，筛选中没有合适的阳性药可供选用，这种比较就更不可能了。因此，这种方法也有极大的局限性。二、高通量筛选结果分析算法研究是研究如何最合理有效地利用高通量筛选所获得的数据，优化研