医学分子生物学复习重点.doc
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1、分子生物学需要掌握的重点一、 DNA、RNA、蛋白质、质粒、基因、端粒、聚合酶、密码子、突变、变性的概念或结构、性质及特点;二、 复制、转录、逆转录、翻译、加工修饰、靶向输送的主要过程及特点;三、 癌基因的概念、原癌基因产物的类型及细胞定位、癌基因活化致癌的主要机制;四、 常用分子生物学技术的原理、主要步骤、酶学及特点;五、 基因表及其调控的原理、主要过程或步骤,乳糖操纵子的正、负调节机制;六、 常用的基因诊断及基因治疗技术;七、 基因克隆、基因诊断、基因治疗、管家基因、抑癌基因、Klenow片段、核蛋白体、限制性内切核酸酶、人类基因组计划、原位杂交的概念;八、 双脱氧末端终止法DNA测序、重
2、组DNA技术的主要步骤;九、 结构基因、顺式作用元件、启动子、遗传密码、反式作用因子、氨基酰-tRNA、基因组文库、DNA多态性、转位因子、探针、Tm值、DNA微阵列、DNA甲基化的概念、性质;十、 核酸分子杂交的主要类型、PCR的主要步骤及引物设计;十一、 DNA、RNA及多肽链的合成方向;十二、 真核细胞转染的基本方法;十三、 细胞周期的主要调控点;十四、 DNA损伤及修复的主要类型和机制;十五、 基因文库筛选的主要方法及原理。名词解释l 质粒是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子,是共价闭合的环状DNA分子,能独立进行复制。质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。l 基因指贮存有功能的
3、蛋白质多肽链或RNA序列及表达这些信息所需的全部核苷酸序列,是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位。l 癌基因是细胞内控制细胞生长和分化的基因,具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性,它的结构异常或表达异常,可以引起细胞癌变。l 基因克隆是指把一个生物体的遗传信息(基因片段)转入另一个生物体内进行无性繁殖,得到一群完全相同的基因片段,又称DNA克隆。l 抑癌基因是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因,当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。l 基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料,通过检查基因的存在、缺陷或表达异常,对人体状态和疾病作出诊断的方法和
4、过程。l 管家基因是在生命过程都是必需的,是在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因,它较少受环境因素的影响,其表达方式为组成性基因表达。l klenow片段亦称DNA聚合酶1大片段,为DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段,它除了保留53聚合酶活性及35外切酶活性外,失去了53外切酶活性,它具有的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性,把DNA合成过程中错误配对的碱基去除,再把正确的核苷酸接上去。l 核蛋白体系tRNA与蛋白质结合生成的一种复合体,是蛋白质生物合成的场所。l 限制性内切核酸酶能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切核酸酶,是基因克隆中
5、最重要的工具酶,通常所说的限制酶是指2型酶。主要从原核细胞中提取,大多数限制性内切酶是错位切割双链DNA,产生粘性末端,部分酶则沿对称轴切割DNA而产生平端。l Tm值DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成的,在这一范围内,紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度,又称融解温度(Tm),其大小与G+C含量成正比。或:双链DNA变性一半所需要的温度叫DNA的融解温度. l DNA的甲基化是指DNA的一级结构中,有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰,其作用是对自身DNA产生保护作用。l 原位杂交是核酸保持在细胞或组织切片中,经适当方法处理细胞或组织后,将标记的核酸探针与细胞或组
6、织中的核酸进行杂交的方法。l DNA微陈列系直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面所组成的微陈列(基因芯片)称为DNA微陈列。. l 顺序作用元件是指那些与结构基因表达调控相关,能被基因调控蛋白异性识别和结合的DNA序列,抱括启动子.上游启动子元件.增强子.加尾信号和一些反应元件。l 转位因子是指能够在一个DNA分子内或2个DNA分子之间移动的DNA片段。l 基因治疗-是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因,或采用特定方式关闭和抑制异常表达基因,达到治疗疾病目的的治疗方法。综合内容DNA的结构、性质及特点一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序,二级结构是指两条D
7、NA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构和四股螺旋结构;三级结构是指双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。DNA一级结构的基本特点:4种脱氧核糖核苷酸以3,5磷酸二酯键相连,形成长链,链中的脱氧核糖和磷酸都是相同的。组成DNA的碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA是由两条单链结合在一起形成的双链分子,两条单链都是由A、T、G、C以千变万化的排列组合而形成的。大多数生物的遗传信息都是储存在DNA分子中。DNA分子主要携带两类遗传信息,即有功能活性的DNA序列所携带的信息和调控信息。DNA二级结构是指DNA的双螺旋结构,其特点为:脱氧核糖与磷酸交替排列构成了DN
8、A主链;两条脱氧核苷酸链是反向平行排列,一条是53方向,另一条为35方向;以右手方向盘绕成双螺旋构型;A配T,G配C。生物体的闭环DNA都以超螺旋形式存在,如细菌质粒、一些病毒、线粒体的DNA等。RNA的结构、功能、特点由4种基本的核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接而成的长链,碱基中没有T,而为尿嘧啶(U)。分为mRNA(信使RNA),tRNA(转RNA,转运氨基酸)和核蛋白体RNA(rRNA)。mRNA结构特点:不稳定、代谢活跃,更新迅速,寿命短。原核生物mRNA具有操纵子结构,主要是多顺反子,mRNA5端无帽子结构,3端一般无多聚A尾巴,没有修饰碱基;真核mRNA5端有帽子结构、3端大多有多聚
9、腺苷酸尾巴、分子中可能有修饰碱基,主要有甲基化、有编码区和非编码区。tRNA的结构特点及作用:作用:在蛋白质合成过程转运氨基酸,参与蛋白质的翻译。一级结构含有稀有碱基如DHU,3端为3个同样的核苷酸序列(CCA)序列,此序列是tRNA结合和转运安基酸而生成氨酰tRNA所必需的。5端为G、具有TC;二级结构为三叶草形,三级结构为倒L形; C、rRNA即核蛋白体RNA:为细胞内含量最丰富的RNA,约占细胞总RNA的80%以上,参与组成核蛋白体,作为蛋白质生物合成的场所。原核生物核糖体的沉降系数为70S,由50S和30S两个大小亚基组成,30S小亚基含16SrRNA和21种蛋白质,50S大亚基含23
10、S和5SrRNA以及34种蛋白质;真核生物细胞核糖体的沉降系数为80S,由大小亚基组成,40S小亚基含18SrRNA及30多种蛋白质,60S大亚基含3种rRNA(28S.5.8S.5S)以及大约45种蛋白质。hnRNA即核内不均-RNA,为真核生物转录生成的mRNA前体。SnRNA即小分子核内RNA,不单独存在,常与多种特异的蛋白质结合在一起,形成小分子核内核蛋白颗粒,在mRNA的剪接中起重要作用。反义RNA,又称调节RNA,主要封闭RNA。参与蛋白质合成的氨基酸在特异的氨基酰tRNA合成酶催化下,与其相应的tRNA结合成氨基酰tRNA。真核生物起始tRNA结合的氨基酸为蛋氨酸,结合形成Met
11、-tRNAimet,翻译起始时首先与40S核糖体小亚基结合形成复合物。原核生物的起始氨基酸为甲酰化蛋氨酸,结合形成fMet-tRNAffmet。导致DNA变性的常用方法有热变性、碱变性和化学试剂变性。DNA变性的结果:粘性降低,密度增加,A260紫外吸收值增加。蛋白质的结构、功能特点蛋白质又称为“功能分子”,根据功能分为结构蛋白、活性蛋白和信息蛋白。蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸排列的顺序。蛋白质一级结构发生改变,可以使蛋白质的功能发生改变,严重时可导致疾病的发生。因基因突变而导致的蛋白质一级结构改变后表现出生理功能的异常,使机体出现病态现象,称为分子病。蛋白质的二级结构单元(形式)
12、有a-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲。一级结构的化学键是肽键及二硫键;二级结构主要化学键为氢键;三级结构的主要靠疏水作用、离子键、氢键和范得华力等;四级结构的结合力主要是疏水作用、氢键和离子键。端粒的主要特点和功能:特点为:位于真核生物染色体末端、端粒酶催化端粒DNA延长、在决定细胞寿命中起重要作用、含短的高度重复序列。其主要功能有:保护线性DNA的完整复制、保护染色体末端、决定细胞的寿命。DNA聚合酶(DNApol)作用是催化DNA合成,其活性需要Mg2+的存在。大肠杆菌DNA聚合酶有I-II、II3种(即原核生物DNA聚合酶)。DNApolI的功能有:a、聚合作用,使DNA链沿53方向延
13、伸,b、35外切酶活性,即能从DNA链3端开始沿35进行水解反应,产生5单核苷酸,纠正复制过程中的错误,保证DNA复制的正确性,因而具有校对功能;C、53外切酶活性,参与RNA生物的切除、填补冈崎片段间的空隙以及DNA损伤的修复。DNApolII:具有53DNA聚合酶活性及35外切核酸酶活性,可能参与DNA损伤的应急状态修复。DNApolII:亚基具有催化合成DNA的功能;亚基具有35外切酶活性及编辑和校对功能,则为装配所必需,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA聚合酶的共同性质是:需要DNA模板;RNA或DNA作为引物;ATP与Mg2+的参与;以dNTP作底物;DNA合成的方向是5
14、3。反应特点:新生链的延伸方向为53;半保留方式合成子代DNA双链;反应需要DNA引物。共同具有的酶活性:53聚合酶活性;35核酸外切酶活性。RNA聚合酶RNA聚合酶也称依赖DNA的RNA聚合酶,能以DNA为模板,四种核苷三磷酸为底物,按照碱基配对原则,从53方向延长RNA链。原核生物的RNA聚合酶只有一种,是由四种亚基2组成的五聚体蛋白质,称为全酶。去掉亚基后,剩下的2称为核心酶。活细胞的转录起始,需要全酶;而核心酶负责催化RNA链的延伸。 真核生物RNA聚合酶有三种,即RNA聚合酶I、II、III。RNA聚合酶I定位在核仁,主要转录5.8S、18S、28S-rRNA基因;酶II定位在核浆,
15、主要转录编码蛋白质的基因,即主要转录产生mRNA;酶III定位在核浆,主要转录tRNA和5S-rRNA基因。RNA聚合酶催化聚合反应时需要有Mg2+或Mn2+的存在,无35外切酶海性,无校对功能。密码子分为起始密码和终止密码,起始密码为AUG,终止密码为UAA、UAG和UGA,共有64种不同的密码。可作为原核生物起始密码的是:AUG.GUG.UUG。遗传密码具有以下特点:连续性:两个密码子之间没有任何核苷酸加以分隔,即密码是无标点的。B、方向性:mRNA中密码子的排列是有方向性的,即起始密码子总是位于编码区5末端,而终止密码子位于3末端。每个密码子的三个核苷酸也是53方向阅读,不能倒读。C、简
16、并性:是指遗传密码中除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外,其余氨基酸有26个密码子为其编码。D、通用性:从最简单的病毒、原核生物、直至人类,都使用同一套遗传密码。E、摆动性:翻译过程中,氨基酸的正确加入,要靠mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相辩认。密码子与反密码子配对辩认时,有时不完全遵守碱基互补规律,即使不严格互补也能辩认配对,这种现象称为摆动。转录的过程及特点转录是以DNA为模板,以4种NTP为原料,依碱基配对规律,在DNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA的过程,其过程包括:起始、延长和终止三个阶段。转录的特点:A、对于一个基因组来说,转录只发生在一部分基因,而且每个基因的转录都受
17、到相对独立的控制。B、转录是不对称的。C、转录时不需要引物,而且RNA链的合成是连续的。D、转录的单向性,即RNA生物合成时,只能向一个方向进行聚合,所依赖的模板DNA链的方向为35,而RNA链的合成方向为53。E、有特定的起始和终止位点。参与转录终止的因素为因子或转录产物的3端发夹结构,转录终止的修饰点:AATAAA+GT序列。原核生物DNA复制的过程及特点复制过程包括:起始(复制起始位点识别、解螺旋酶解开DNA双链,引发体合成RNA引物)延伸(DNA聚合酶催化聚合反应,连续合成前导链,不连续合成随从链)。终止(RNA引物去除、冈崎片段连接、在特殊的终止结构区域停止)。复制的共同特点为:半保
18、留复制和半不连续复制、聚合反应都需要模板、底物、DNA聚合酶及其它酶和蛋白质。真核生物染色体DNA复制的特点:(原核相反)复制起始点为多个;复制叉移动速度慢;复制方向大多数为双向;RNA引物短;冈崎片段短,不可连续复制翻译的主要过程及特点起始:形成翻译起始复合物延长:指每加一个氨基酸经过进位、成肽和转位,使肽链从N端向C端延长。终止(当mRNA分子中的终止密码子出现后,多肽链合成停止,肽链从肽酰-tRNA中释出,mRNA、核蛋白体等分离)。蛋白制合成是一个耗能过程,每生成一个肽键,要消耗2个高能磷酸键,氨基酸活化要消耗2个高能磷酸键,整个过程可能多于4个高能磷酸键。14、原核生物mRNA的加工
19、:转录产物mRNA分子不需加工。tRNA结构基因的初级转录产物需要加工,才能成为具有生物功能的成熟分子。tRNA前体的加工包括剪切作用(切除多余核苷酸)、添加和修复3端CCA序列,某些碱基的化学修饰(成熟tRNA分子中有稀有碱基)。翻译后的加工修饰:加工包括:A、去掉N-甲酰基、N-蛋氨酸或N端序列。B、个别氨基酸的修饰(羟化、磷酸化形成-S-S-等)。C、多蛋白水解修饰,D、分子伴侣,蛋白质二硫键异构酶,肽-脯氨酰顺反异构酶辅助折叠成空间构象。E、亚基聚合,F、辅基的结合(糖基化等)。其中A、B、C属一级结构修饰,D、E、F属空间结构修饰。多肽链形成后,氨基酸残基可进行多种共价修饰,包括;磷
20、酸化,羟基化,ADP-核糖基化,形成胱氨酸及乙酰化。翻译过程涉及多种分子之间的相互作用,可以归纳为:RNA-蛋白质相互作用,蛋白质-蛋白质相互作用及RNA-RNA相互作用。参与翻译终止的蛋白质因子包括:RF、PR、IF。广义的核蛋白体循环包括:翻译起始,进位,成肽,转位和翻译终止。真核生物mRNA的加工包括:5端加帽(由加帽酶催化5端加入7-甲苷乌苷酸,形成帽子结构m7GpppmNP-)。 3端加入Poly(A)尾(A、组蛋白的成熟mRNA无需加polyA尾;B、加尾信号包括AAUAAA和富含GU的序列;C、加尾不需模板;D剪切过程需要多种蛋白质因子的辅助)。mRNA前体的剪接(剪接加工以除去
21、内含子序列,并将外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子。内含子两端的结构通常是5-GUAG-3。选择性剪接的作用机制包括;A使用不同的剪接位点,B选择使用外显子,C、反式剪接,D、使用不同的启动子,E、使用不同的多腺苷酸化位点)。RNA的编辑(发生于转录后水平,改编mRNA序列,CU或AG,增加遗传信息容量)。基因表达是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质,tRNA、rRNA编码基因转录生成RNA的过程也属于基因表达。基因表达受到多级水平的调控,具有阶段特异性(
22、时间特异性)和组织特异性(空间特异性)。基因表达分为几个阶段:基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等、产物是RNA和有功能的蛋白质。原核生物基因表达调控的环节,主要在转录水平,其次是翻译水平。原核生物基因多以操纵子的形式存在,转录水平的调控涉及到启动子、因子(能与RNA聚合酶结合)、阻遏蛋白(负调控)、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等多种因素。而翻译水平的调控涉及到SD序列(位于AUG前)、mRNA的稳定性(不稳定,其5端和3端的发夹结构可保护其不被酶水解,mRNA的5端与核糖体结合,可明显提高其稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较
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