蛋白酶抑制剂的研究进展.doc
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1、蛋白酶抑制剂的研究进展郭川微生物专业,200326031摘要:自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂,本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点,活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。关键词:蛋白酶抑制剂;结构;应用天然的蛋白酶抑制剂()是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等,PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成
2、部分。从等最早分离纯化出一种至今,已有多种被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂1。1 结构与功能1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor,Serpin)丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异
3、进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30的同源序列,疏水区同源性高达70。血浆中的serpin多被糖基化,糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端3040个氨基酸处的环状结构区RSL(reactive site loop)中,存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P12;近C端与P1相邻的氨基酸为P1,依此类推,即肽链结构表示为N端-P15P9P1-P1P9P15-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物,同时P1-P1间的反应活性位点断
4、裂。几种perpin氨基酸序列比较发现,serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的,且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶,抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶,其中P1为Arg2。1.2巯基蛋白酶抑制剂(Cytsteine Proteinase Inhiitor,CPI)对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和
5、F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如2中的Gln-Val-Gly和CH-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用3。对植物来源的研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归
6、为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu-Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu-Gly保守区域外,OCI序列中其它区段对其功能也有影响。利用pUC18构建了不同的OCI端、端序列缺失的表达载体,进行原核表达,其产物以-苯甲酰精氨酰-2-萘氨为底物,缺失试验表明,当端缺失21个氨基酸残基或端缺失11个氨基酸残基时, OCI同样具有显著的抑制活性,但当端缺失至38个氨基酸残基或端缺失至35个氨基酸残基时,则抑制活性显著下降,虽然这时缺失产物
7、中仍含有Glu-Gly区段。因此认为OCI的抑制活性是其两端区域与Glu-Gly区段协同作用的。尤其是端的Pro7可能形成一个特殊结构来阻止酶的水解,从而使抑制活性完全丧失。1.3 金属蛋白酶抑制剂(metalloproteinase inhibitor)基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,)是锌金属蛋白酶的一族,对胞外基质的降解起着主导作用,与结缔组织的降解和重建有关。在体内通过特定的途径调节。若调节发生紊乱,将导致各种疾病的发生,如关节炎、肿瘤和组织溃烂等5。基质金属蛋白酶(MMPs)拥有一个共同的活性位点模式:三个组氨酸残基(His218,His222,H
8、is228)结合催化部位锌离子。Glu219,作为催化部位的广义酸碱催化剂; Ala182,其羰基氧与肽键的形成氢键; Leu181和Tyr240,其侧链组成一道“墙”将1和3隔开,并供一供体与底物形成氢键; Pro238和Ala234,其羰基指向1区域。从酶的三级结构来,MMP分子中包括3个螺旋和4个平行、1个反行折叠。从与底物或抑制剂作用的模式来看,分为两个部分:(1)端催化部位;(2)酶的疏水区1,1,2,3。各种及其亚型在氨基酸序列的同源性很强,仅在局部区域有不同。这种差异要体现在酶的1疏水区 4,5。抑制剂可分为组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloprp
9、teinases,)和合成抑制剂, TIMPs存在于多种组织中,它与肝纤维化的发生发展密切相关。目前已发现4种TIMP成员: TIMP1、TIMP2、TIMP 3、TIMP4。TIMP1是一种分子量为29(25 36)的蛋白质,其蛋白分子中包含184个氨基酸,其中含有12个高度保守的半胱氨酸残基,形成6个二硫键,把TIMP1分子分成两个结构域。TIMP1转录本长度为0.9。TIMP2与人TIMP1相同,它同样含有12个高度保守的半胱氨酸残基位点,并且有3/4的色氨酸残基与TIMP1相同,其转录本大小为1.03.5。TIMP3 由188个氨基酸组成,也具有12个高度保守的半胱氨酸残基,其与TIM
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