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微生物学实验指导
黄文芳　张　松　编著
华南师范大学生命科学学院

 第一部分 基础实验

实验1 培养基的配制

一、实验目的和内容
目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。
2．高氏1号培养基的配制。
3．马丁氏培养基的配制。
二、实验材料和用具
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。
三、操作步骤
（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6
1．称药品 　按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3． 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7．包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8．灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。
9．摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。
10．无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二）高氏l号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（三）马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。
1．称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。
3．链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素30μg。
四、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
五、实验报告
记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
六、问题和思考
l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
3．试设计实验对饮料进行无菌检查。

实验2 消毒与灭菌

一、干热灭菌
（一）目的要求
1．了解干热灭菌的原理和应用范围。
2．学习干热灭菌的操作技术。
（二）基本原理
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图2-1。

图2-1 电烘箱的外观和结构
A.外观 B.结构
1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关;
8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器;
14. 散热板; 15.搁板
（三）器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱等。
（四）操作步骤
1．装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。
物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
2．升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。
3．恒温
当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。
干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
4．降温
切断电源、自然降温。
5．开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。
电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
（五）实验报告
思考题
l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?
2．为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。
二 高压蒸气灭菌
（一）目的要求
1．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。
2．学习高压蒸气灭菌的操作方法。
（二）基本原理
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2—1），二是湿热的穿透力比干热大（表2—2），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表2—1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵白蛋白含水量/%
30分钟内凝固所需温度/℃
50
56
25
74～80
18
80～90
6
145
0
160～170
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2—3）

表2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较
温度/℃
时间/h
透过布层的温度/℃
灭菌
20层
10层
100层
干热130-140
4
86
72
70.5
不完全
湿热105.3
3
101
101
101
完全

表2—3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数
全部空气排出时的温度/℃
2/3空气排出时的温度/℃
1/2空气排出时的温度/℃
1/3空气排出时的温度/℃
空气全不排出时的温度/℃
Mpa
Kg/cm2
Ib/in2
0.03
0.35
5
108.8
100
94
90
72
0.07
0.70
10
115.6
109
105
100
90
0.10
10.5
15
121.3
115
112
109
100
0.14
1.40
20
126.2
121
118
115
109
0.17
1.75
25
130.0
126
124
121
115
0.21
2.10
30
134.6
130
128
126
121
现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图2-2，A）和手提式（图2—2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。

图2—2A 卧式灭菌锅

图2—2B 手提式灭菌锅
1. 安全阀; 2.压力表; 3.放气阀; 4.软管; 5.紧固螺栓; 6.灭菌桶; 7. 筛架; 8.水
（三）器材
牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅等。
（四）操作步骤
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
（五）实验报告
l．结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2．思考题
（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?
（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?
（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?
三、紫外线灭菌
（一）目的要求
了解紫外线灭菌的原理和方法
（二）基本原理
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。
此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。
（三）器材
1．培养基 牛肉膏蛋白胨平板。
2．溶液或试剂 3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液。
3．仪器或其他用具 紫外线灯。
（四）操作步骤
l．单用紫外线照射
（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。
（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。
（3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
2．化学消毒剂与紫外线照射结合使用
（1）在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。
（2）无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。
（3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”(3)]。
因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。
（五）实验报告
1．结果
记录两种灭菌效果于下表中
处理方法
平板菌落数
1 2 3
灭菌效果比较
紫外线照射
3%～5%石炭酸+紫外线照射

2%～3%来苏尔+紫外线照射

2．思考题。
（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？
（2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通灯用玻璃？
（3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？
四 微孔滤膜过滤除菌
（一）目的要求
1．了解过滤除菌的原理。
2．掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。
（二）基本原理
过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。
（三）器材
1．培养基 2%的葡萄糖溶液，肉汤蛋白胨平板。
2．仪器或其他用具 注射器，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。
（四）操作步骤
l．组装、灭菌
将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用(0.lMPa，121.5℃灭菌20min)。
2．连接
将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图2—3。
3．压滤
将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。
压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶．
4．无菌检查
无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃温室中培养24h，检查是否有菌生长。
5．清洗
弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。
整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。
（五）实验报告
l．结果
记录无菌检查结果
2．思考题
(1)你做的过滤除菌实验效果如何?如果经培养检查有杂菌生长，你认为是什么原因造成的?
(2)如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度(或工作浓度)为50μg/ml，你将如何操作?
(3)过滤除菌应注意哪些问题?

实验3 土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术

一、实验目的和内容
目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
内容：
l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线方法分离微生物。
3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、实验材料和用具
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris)斜面菌种。
已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。
三、操作步骤
(一)土壤稀释分离
1．取土壤 取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．制备稀释液(要无菌操作)
(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

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图3—1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解
3. 混菌法测定菌落数的方法
(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。

图3—2 倒平板的方法
（2）放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
（3）霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。
4．培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
（二）平板制作及划线分离方法。
1．倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作（图3—2），做法如3（1）。
2．划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图3—3。

图3—3 平板划线方法示意图
A. 划线分离操作; B.用于稀释液中, 可连接划线;

C. 用于较浓的菌样, 分数次划线, 每次划线后要烧接种环, 然后再划下一区。
3．培养 方法同“土壤稀释分离”。
（三）斜面接种和穿刺接种
1．斜面接种
（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。
（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。

图3—4 斜面接种（A）及穿刺接种（B）示意图
（3）接种后30℃ 恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。
2．穿刺接种
（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。
（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。
（3）接种后30℃恒温培养， 24h后观察，比较两种菌的生长结果。
四、注意事项
1．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
3．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
五、实验报告
1．记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。
计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式：
总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
2．分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。
3．比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析。
七、问题和思考
1．在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法?
2．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。

实验4 微生物菌落的观察

一、实验目的和内容
目的：识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。
内容：
1．观察已知菌的菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征。
2．根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。
二、实验材料和用具
大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘红酵母(Rhodotorula gracitis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus，又称“5406”抗生菌)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus )、黑曲霉(Aspergillus niger )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveria bassiana)等细菌的斜面菌种。
牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏1号培养基、无菌水。
接种环、接种针、酒精灯、无菌培养皿多套、电热恒温箱。
三、操作步骤
(一)制备已知菌的单菌落
1．制备平板 将已融化的无菌培养基待冷却至50℃左右，分别制备牛肉膏蛋白胨培养基平板、马铃薯蔗糖培养基平板和高氏1号培养基平板各一皿。
2．制备菌悬液或孢子悬液 在培养好的斜面菌种管内加入5mL无菌水，制成菌悬液后备用。
3．制备单菌落 通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种法获得霉菌的单菌落。细菌于37℃恒温培养24～48h，酵母菌于28℃培养2～3d，霉菌和放线菌置28℃培养5～7d，待长成菌落后，仔细观察四大类微生物菌落的形态特征，并将观察结果记录于表4-1中。
(二)制备未知菌落
l．倒平板
2．接种 可用弹土法接种，其要点为：采集校园土壤，待风干磨碎后，可将细土撒在无菌的硬板纸表面，先弹去纸面浮土，然后打开皿盖，便含土的纸面对着平板培养基的表面，用手指在硬板纸背面轻轻一弹即可接种上各种微生物。
3．培养 将牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37℃培养箱中恒温培养2～3d，将马铃薯蔗糖培养基倒置于28℃培养箱中恒温培养3～5d，即可获得未知菌的单菌落。
4．编号 从培养好的未知平板中，挑选8个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将判断结果填入表4～2中。
(三)直接观察菌落
直接用实验3中的“土壤稀释分离”获得的单菌落进行观察识别，并将结果填入表4-2中。
四、注意事项
观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较大菌落；已知菌落和未知菌落要编好号，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。
五、实验报告
1．已知菌落的形态特征记录于表4～1中。
2．将未知菌落的辨别结果记录于表4～2中。
七、问题和思考
1．试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态的差异?
2．设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别?
表4—1 已知菌菌落的形态
微类生物数
菌名
辩别要点
菌落描述
湿
干
表面
边缘
隆起形状
颜色
透明度
厚薄
大小
松密
大小
正面
反面
水溶性色素
细菌
大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草杆菌

酵母菌
酿酒酵母

粘红酵母

热带假丝酵母

放线菌
细黄链霉菌

灰色链霉菌

霉菌
产黄青霉

黑曲霉

球孢白僵菌

表4—2 未知菌菌落的形态
菌落号
湿
干
菌落描述
判断结果
厚薄
大小
松密
大小
表面
边缘
隆起形状
颜色
正面
反面
水溶性色素
透明
度
1
2
1

2

3

4

5

6

7

8

注：四大类微生物菌落的识别要点如下：

菌落
湿润：正反面颜色一致
小
大而扁平…………
小而扁平…… 细菌
大
大而扁平……
大而隆起……酵母菌

干燥，正反面，中央与边缘颜色不一致
小 小而致密
大
大而致密……
霉菌
大而疏松……

实验5 显微镜油浸系物镜的使用

一、实验目的和内容
目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
二、实验材料和用具
枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。
香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
三、操作步骤
(一)观察前的准备
1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片
首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察
眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察
1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。
4．再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。
(五)镜检完毕后的工作
1．移开物镜镜头。
2．取出装片。
3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。
4．擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。
四、注意事项
1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察
2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。
3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。
4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。
五、实验报告
分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。
六、问题和思考
1．用油镜便于观察细菌的依据是什么？
2．使用油镜应特别注意哪些问题？
3．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？
油镜的基本原理
（一）油镜头的辨认
油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短（图5—1）

图5—1 显微镜物镜参数示意图
（二）显微镜的分辨率
显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。

从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积；

影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由