细胞克隆形成实验(2).doc
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1、仅供个人参考细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大:一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞
2、系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。实验方法:平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验?(a)?平板集落形成实验:本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞?(b)?软琼脂集落形成实验:本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。平板克隆形成实验基本步骤:1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37 5% CO2及饱和湿度的细
3、胞培养箱中培养23周。3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染1030分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)100%平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。平板克隆形
4、成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。软琼脂培养克隆形成试验基本步骤:?(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。?(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40中不会凝固。?(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2DMEM培养基(含有2抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注
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