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炎症与动脉粥样硬化
Peter Libby
摘要
实验研究表明炎症可以通过炎性分子和细胞路径促进动脉粥样硬化。为阐明细胞因子作为炎性信使促使动脉粥样硬化病变，并导致全身性内环境变化从而有利于粥样硬化的发生的作用机理。本研究基于同种异体移植物动脉粥样硬化的免疫研究证明，即使没有传统的风险因素存在，炎症本身也可以推动动脉增生。斑块激活血小板导致动脉粥样硬化的并发症——血栓的形成。这些研究为人类的医学研究提供了新的方向和实用的临床进展。
炎症：一种持久的火焰
在上个世纪的大部分时间里，人们都认为动脉粥样硬化是一种胆固醇储积的疾病，这种储积是以胆固醇和血栓碎片在血管壁上堆积为特征。而十九世纪六十至七十年代的现代细胞生物学侧重于平滑肌细胞的增生是作为动脉粥样硬化斑块的发源地的观点。在过去的四分之一世纪里，认为炎症反应是动脉粥样硬化的根本原因，并且这一观点得到越来越多的认可。然而，正如很多科学界和医学界的创新一样，这种看似新颖的观点其实很早就已经存在了。
5000多年前的埃及沙草纸就记录了发热、发红一定伴随着疾病的发生。在第一个世纪，Aulus Cornelius Celsus就定义了炎症反应的主要特征：发红、肿胀、发热和疼痛。显微镜和苯胺染色技术的出现为细胞病理学和炎症细胞生物学时代奠定了基础。在19世纪，敏锐的观察者描述了白细胞由血液向组织的渗出。Rudolf Virchow确定了动脉硬化的斑块的炎症性质：“在某些情况下，尤其是暴力情况下，那些软化物软化自身，这种情况甚至出现在动脉血管中，这种软化并不是脂肪过程的结果，而是作为炎症反应的产物。”Virchow也了解动脉粥样硬化是一个活跃的组织反应过程而不仅仅是血栓的覆盖或脂肪淤积，并这样描述：通常发生炎症反应的部位都伴随着脂肪的变性，并提供了大量的证据证明炎症反应的过程不可能只是个简单的被动过程。Virchow动脉粥样硬化的观点，其中的要素显然是现代化的，但不幸的是，当时主要观点认为脂肪的被动淤积是导致动脉粥样硬化的主要因素，而这种错误的观点霸占了一个多世纪。
期间，实验师们为现代免疫学奠定了基础，Paul Ehrlich研究了抗体并推进了抗原与抗体互补的观点——类似于一把钥匙只能开一把锁。他的这种革新性的观点建立了适合于免疫学领域的基础。Ilya Mechnikov在19世纪末发现了细胞吞噬作用，证明了我们现在称之为先天性免疫的领域基础，Ehrlich 与 Mechnikov在1908年共同获得了诺贝尔奖，因为他们在免疫学和机体防御上获得的开创性的研究。然而，这种观点在动脉粥样硬化上的应用推迟了近一个世纪。
先天性免疫与动脉粥样硬化
从Virchow时代开始，病理学家就意识到载脂泡沫细胞为动脉粥样硬化的标志。尽管平滑肌细胞和内皮细胞也可以被脂质填满，但由于单克隆抗体的发展使得严格的细胞识别得以实现，从而确认大部分的泡沫细胞来自于单核吞噬细胞。尽管如此，大多数学者仍然认为巨噬细胞是脂质斑块的坟墓而非动脉粥样硬化的积极参与者。泡沫细胞的形成可能导致坏死灶的形成，坏死灶被设想成细胞残片和脂质的仓库。事实上，一些早期的动脉粥样硬化的细胞生物学描述是一个温和的过程，并没有炎性细胞的参与。单核吞噬细胞作为效应器出现并释放巨噬细胞衍生介质,如细胞因子。在动脉粥样硬化过程中，单核巨噬细胞与血管细胞之间的动态相互作用（图1）曾经被忽视或质疑，这种事情似乎已经是司空见惯了。

图1. 此图显示了早期（1989）对炎症细胞与壁细胞通过细胞因子介导的相呼应答的描述。世界各地均已证实了此图假设的原理。图片最低顶端的T淋巴细胞受到抗原刺激产生细胞因子，如γ-干扰素(IFN-γ)，淋巴毒素(LT)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。这一顺序代表了适应性免疫应答反应。这些细胞因子作用于图片中部的巨噬细胞/单核细胞，使其合成并分泌先天免疫介质，如白介素(IL)-1和(IL)-6，以及血小板衍生生长因子(PDGFc)和转化生长因子(TGF-α)。因此，巨噬细胞/单核细胞主要参与的是先天免疫。这些单核吞噬细胞产生的细胞因子调节内皮细胞旁分泌信号(ECs,左下)或血管平滑肌细胞(smc,右下)。HLA表示人类白细胞抗原。
炎症细胞与动脉粥样硬化
内皮细胞表达的粘性分子的发现为动脉粥样硬化病变的启动提供了重要见解。如内皮细胞分泌的血管细胞粘附分子-1，使动脉粥样硬化早期由单核细胞和T淋巴细胞累积组形成的斑块粘附。1958年，Poole and Florey 观察到在兔子的高胆固醇血液中单核细胞通过白细胞粘附分子介导刺激未损伤内皮细胞。 粘附分子诱导单核细胞附着，一旦附着成功，接受到化学信号的刺激，单核细胞就会进入血管内膜。趋化因子，如单核细胞趋化蛋白-1，在趋化过程中起着至关重要的作用。在动脉粥样硬化斑块早期，γ-干扰素诱导产生的三重趋化因子也是有选择性的聚集T淋巴细胞。
单核细胞在动脉血管内膜成熟，成为巨噬细胞。在斑块中，这些单核巨噬细胞表达必要的清道夫受体，从而吞噬变性的脂蛋白成为泡沫细胞。在寻找确认单核巨噬细胞成熟机制过程中，我们和其他人都定位了斑块局部单核巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。体外研究显示，在动脉粥样硬化损伤早期，单核巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可能诱导清道夫受体表达，并促进单核细胞增值。坏死灶的形成也可能反映了单核吞噬细胞的高度调节功能。我们在1992年就报道过：载脂单核细胞的死亡并非偶然，也不可能是因为载脂过多导致破裂，就像过量充气的气球爆炸那么简单。事实上，这个过程可能与细胞凋亡有关，凋亡为细胞死亡的一种程序化形式。脂肪核心部分的渐进性坏死可能与像人类单核细胞生存所必须的M-CSF等细胞因子的浓度梯度有关。M-CSF的超表达可能发生在损伤的开始或者初期，这个阶段的特征是持续的细胞活化。另外，斑块核心的M-CSF的相对消耗可能支持渐进性坏死16。
巨噬细胞也在关键点导致动脉粥样硬化的并发症——血栓的形成。胶原是斑块的纤维帽的关键组成部分，巨噬细胞产生大量的酶使胶原异化。早在20世纪90年代，我们就假设过这种属于基质金属蛋白酶(MMP)家族成员的间质胶原酶地超表达威胁了纤维帽对斑块结构生物力学稳定性的保护，是斑块破裂的诱因17。
间质胶原酶（ MMP-1、MMP-8、MMP-13）超表达发生在人类动脉粥样硬化和运载有蛋白酶与斑块间质胶原蛋白的降解产物的游离性白细胞中18。我们随后的试验阐明了炎症因子通过单核吞噬细胞介导促进了MMP间质蛋白酶的表达，为斑块破裂和血栓形成做好了准备。我们随后通过老鼠的遗传或药物作用的功能获得或缺失实验，证明了MMP胶原蛋白酶在斑块胶原成分中的作用19-22。
巨噬细胞和动脉粥样硬化的平滑肌细胞也会超表达促凝血因子。现已经确认炎症介质CD40配体（CD154）是由人类巨噬细胞分泌的组织因子，也是与疾病相关的激活蛋白。因此，炎症的形成既包括斑块的促凝性，也包括斑块纤维保护帽的完整性。这些发现提供了有力的证据说明血栓是动脉硬化的并发症。这个过程的发现表明炎症介质参与了动脉粥样硬化的全过程，从损伤开始、发展，直到临床发病。
血管壁细胞衍生因子可提供动脉粥样硬化的最初免疫反应的导火索
研究发现，血管壁自身可以产生细胞因子、炎症蛋白介质和免疫力，这可能为动脉粥样硬化的启动提供了一个重要的研究方向。根据最初的概念，介导白细胞的细胞因子根据其功能称之为白介素（IL）。在20世纪90年代，我们的工作就证明了人类内皮细胞与平滑肌细胞不仅对细胞因子做出反应，而且，也可能产生这一类的炎症介质24,25（图1）。脂蛋白的氧化产物和血管紧张素II，还有一些与动脉粥样硬化传统的风险因子关系密切的因素，如高血脂和高血压，都可能导致血管壁细胞产生细胞因子26,27。因此，早期对专一损伤部位炎症细胞募集的刺激可能来自于损伤处血管壁细胞的产物，如刺激粘附分子和趋化物的表达。
损伤生根（take root）之前，固有的血管壁细胞可能通过动脉粥样硬化风险因子和复杂的炎症介质维持了最初的攻击，这些介质而后会募集并活化专一的炎性细胞，这些炎性细胞在炎症初期扩大并维持炎症的发生。这个发现推动了这样的观点，动脉粥样硬化是一种发生在血管壁细胞与白细胞之间的动态的、复杂的交互反应，而不是最初的观点认为在血管炎症反应中管壁细胞仅仅作为旁观者或者泡沫细胞被动的植入脂质碎片。
炎症反应与动脉粥样硬化中的细胞凋亡
随着动脉粥样硬化病变的发展，巨噬泡沫细胞与血管平滑肌细胞凋亡。如上所述，巨噬细胞死亡导致脂质核心的形成。平滑肌凋亡的过程，我们认为是炎症介质的驱使，也可能与损伤并发症有关28。我们在1995年就进一步明确了这个假说——平滑肌细胞凋亡假说——解释了为什么斑块区域血栓的破裂和诱发含有少量平滑肌细胞29,30。平滑肌细胞产生大量的胶原蛋白增加了纤维帽的强度。平滑肌细胞的缺失导致细胞凋亡，也可能导致炎症斑块胶原蛋白的不足，从而导致斑块破裂并趋向于血栓的形成。我们还为之前描述的细胞凋亡提供了数据，指出在损伤过程过，我们称之为持续延长的细胞凋亡。我们阐述为：“一些在动脉硬化损伤中凋亡的细胞可能并没有消失，而是以木乃伊化的状态积累在纤维化的损伤处29。Ira Tabas31在随后的研究中详细的阐述了斑块中细胞凋亡的损伤清除率、胞葬作用。
单核吞噬细胞的异质性与动脉粥样硬化
最近的研究对动脉粥样硬化中单核/巨噬细胞的长期增强的异质性功能有了新发现。在1992年，我们的团队就提供了巨噬细胞异质性功能是基于基因表达的早期证据32。采用最近识别的细胞表面标志揭示了在动脉粥样硬化中，单核细胞分裂的惊人方式。在高胆固醇血症的小鼠外周血和脾脏中有着高水平的单核细胞，通过高表达的表面标记Ly6C的界定，发现这些单核细胞表现出特别的促炎功能33,34。在重度高胆固醇血症小鼠体内，在脾脏区髓外白细胞的生成强化了单核细胞促炎亚单位。在实验性损伤中，这些细胞从脾脏中出来，累积在动脉粥样硬化区，提供少量实质的单核吞噬细胞35。单核细胞促炎因子亚单位，可能优先以传统的激活方式激活单核细胞的促炎程序。
一些与巨噬细胞表现出的主要促炎程序有关的细胞称之为M1巨噬细胞。巨噬细胞的这种简单的二分法是一种基于特定标志的分类法，可能具有启发价值，但更适合于小鼠而非人类，对于人类，掩盖了重叠激活表征复杂的慢性炎症过程，如动脉粥样硬化模式36。最近的研究进展认为在动脉粥样硬化中单核巨噬细胞的异质性提供了有助于深入了解这种疾病新机理，并且为动脉粥样硬化形成过程中的免疫响应调控提供了新途径。这种在小鼠中夸大的高胆固醇血症，如何应用于人类还在探索中。
动脉粥样硬化中的先天免疫：除吞噬细胞外
在动脉粥样硬化中发现，巨噬细胞占据白细胞的绝大多数。其他先天免疫效应细胞，虽然少很多，但也可能有助于动脉粥样硬化的发病机制。在外膜，肥大细胞早就被注意到并推测有助于血管疾病的形成，最近在动脉粥样硬化实验发现了肥大细胞的参与。药物和基因干预研究结果揭示了肥大细胞在粥样硬化前的粥样作用，20世纪50年代的形态学研究结果已经被此方式的研究结果取代37。我们的研究小组发现，在小鼠实验中，基因缺失肥大细胞可改善动脉粥样硬化38。过继转移实验暗示肥大细胞衍生的IL-6和IFN-γ作为促炎介质促使病变进化。嗜酸性粒细胞和IgE显着激活，也可以加重动脉粥样硬化39。
获得性免疫与动脉粥样硬化
在人体中，巨噬细胞包括绝大多数的炎性细胞和实验性动脉粥样硬化斑块。获得性免疫细胞称为T淋巴细胞和B淋巴细胞，在动脉粥样硬化损伤处，虽然是低水平，但也同样存在。尽管他们数量很少，但在动脉粥样硬化形成时却发挥了决定性的调节作用，尤其是T淋巴细胞。就像军队中士兵显然多于将军，管弦乐队演奏者众多，却只有一个指挥。同样，在动脉硬化中，为数不多的T淋巴细胞通过斑块中巨噬细胞的介导，可能对先天性炎症反应起到调节作用。先前由Hansson 和 Jonasson40发表的一系列文章已经深入描述了细胞免疫在动脉粥样硬化斑块中的发现，这里简单总结如下：
免疫定位第一次记载了T淋巴细胞存在于人类动脉粥样硬化中。由临近细胞产生的组织相容性复合体抗原的的表达为这些T淋巴细胞的功能学意义提供了证据。T淋巴细胞产生γ-干扰素（IFN-γ），诱导平滑肌细胞和巨噬细胞产生组织II类相容性复合体抗原。过继转移实验证明CD4 阳性 T淋巴细胞对小鼠动脉粥样硬化的致病作用41。进一步的研究揭示IFN-γ诱导产生的CD4阳性细胞Th1在小鼠粥样化的早期优势。随后的研究确定了潜在的内源性抗原，包括低密度脂蛋白（LDL）和热休克蛋白60，这些内源性抗原可以在动脉粥样硬化斑块中诱导产生获得性免疫。像单核吞噬细胞，T淋巴细胞具有功能多样性。虽然CD4阳性淋巴细胞Th1表现出加速动脉粥样硬化的作用，但是，调节性T细胞通过转化生长因子β和在某些情况下分泌的IL-10限制了粥样硬化。因此，T细胞亚群之间的平衡可能会影响损伤的形成和特征42,43。
B细胞同样是斑块的组成成分。然而，体液免疫表现出减缓动脉粥样过程的作用。因此，B1细胞引发的天然抗体可能阻止动脉粥样化。脾脏切除可以降低B淋巴细胞水平。在小鼠实验中，脾脏切除后可增强动脉粥样硬化的形成44。接种理论上假定的抗原，如修饰的LDL，将防止动脉粥样硬化。与此相反，B2的淋巴细胞可加重动脉粥样硬化45。事实上，小鼠实验中，采用抗CD20抗体处理耗竭B细胞，机体通过IL-17依赖性限制了损伤规模。因此，B细胞功能对动脉粥样硬化的净影响仍然悬而未决。
免疫介导的动脉粥样硬化的特例：抑制血管病变
实体器官移植是受体动脉粥样硬化诱导的一种特殊形式。即使没有传统风险因子的参与，这种疾病也可迅速发展，仅需短短数月或数年时间。供体动脉参与，与受体原有动脉一起，预示着加速动脉病不是由于移植导致机体系统的改变或为控制排斥反应使用药物造成的。（Involvement of the donor arteries, with sparing of the host arteries, indicates that this accelerated arteriopathy does not result from a systemic change attributable to the transplanted state or from the medications used to control acute rejection.）
早在1989年，我们就推测供体细胞表达的外源性II类组织相容性抗原可通过细胞因子介导刺激受体产生长期的免疫应答，从而导致动脉粥样硬化产生向心性增生47（图1）。我们小组阐明了心脏移植后，冠状动脉内皮细胞II类组织相容性抗原的表达48。进一步观察发现T淋巴细胞位于内膜的内皮下位置，且呈环状排列（图2）。γ-干扰素（IFN-γ）源自于活化的T细胞的，我们预测其可能对移植动脉病症启始和II类组织相容性抗原的表达起关键作用。进一步假设移植动脉硬化中长期的免疫应答，类似于迟发型超敏反应，但不同于CD8 阳性T细胞介导的细胞溶解，这种反应以实质排斥为标志。1997年，我们在转基因小鼠心脏移植试验中获得了直接试验支持：IFN-γ缺失可避免冠状动脉粥样硬化，但是没有出现心脏排斥反应49。虽然其他免疫和非免疫机制有助于解释移植动脉病变的机理，但是结合试验和人类观测确定获得性免疫是本病发展的关键因素。事实证明，即使没有传统风险因素，如高血脂症，炎症机制也可以导致动脉粥样硬化。
动脉粥样硬化对人类疾病的启示
在动脉粥样硬化中，炎症运作机制的发现，导致生物标志物应用的产生，并且这种生物标志物的应用扩展到了动物试验、细胞培养试验和人类标本观察与完好受试者中。炎症的生物标志物，如C-反应蛋白（CRP），在急性心肌梗死的患者体内升高50,51。许多年前就提出，此发现可能与组织损伤响应有关。过去15年的证据表明，炎症（如CRP）生物标志物的微妙增加可以预示表面健康的人的未来心血管事件52。CRP这种生物标志物在一定范围内的波动预示着心血管疾病风险的增加，曾经遇到远低于正常水平的急性患者。所以，高灵敏度（以hsCRP为参考）检测技术的发展允许这种生物标志物作为一种精确的测量工具，以提高风险分级。与其他新的生物标志物一起，hsCRP 作为粥样硬化传统风险因子加入到Framingham算法中。

图2. 此图绘制与1991年，描述了移植手术后动脉病变的发展过程，根据人类损伤观察和体外实验描绘。A. 游离T细胞和单核细胞接触到人类白细胞抗原（HLA）- DR-内皮细胞（ECs）（HLA-DR-ECs），HLA-DR-内侧平滑肌细胞（SMC）驻留在内部弹性薄片的下面。HLA-DR-中层平滑肌细胞(SMCs)驻留在内部弹性膜层的下面。B.在动脉移植病变早期，HLA-DR+ECs叠置于内膜中的T细胞和巨噬细胞上。C.在病变晚期，平滑肌细胞在内膜的深层占主导地位。HLA-DR+ECs、T细胞和巨噬细胞排列在腔内。
与hsPRC有关的传统风险因素有所增加，但这种增加是有限的，约1.5〜1.7，所以，需要调整传统风险因素的值。然而，结合年龄和性别，加入传统风险因素，如总胆固醇和收缩压，增加大约等同数值的风险预测53。最近开发的用于评估临床使用的新的生物标志物，如净重新分类指数，显示的hsCRP可以正确地重新分类个体，特别是在根据传统分类法归类为中间风险群体的时候。而中间风险群体大多数有发生心血管事件的风险。从专业领域得到的一些建议和指导，现在把hsCRP纳入风险预测算法。Reynolds 风险评估，特别是将hsCRP和中过早发生冠状动脉病的家族病加入了传统风险因素评估后，成为临床非常有帮助的评估方法54。
炎症生物标志物的成功应用增强了心血管风险评估，且独立于传统的危险因素，如高胆固醇血症，表明炎症生物标志可用于物识别那些受到干预（intervention）的个体，尽管心血管风险按照传统风险因素估计较低。例如，他汀类药物，是有效地降低低密度脂蛋白（LDL），降低患者心血管疾病危险的一大类药物，并通过降低CRP作为减少炎症的依据。在一个个体中，他汀类药物引起的LDL的降低与CRP降低的相关性非常低。这一发现，在众多大型临床试点推广，预示LDL和炎症是非常独立的变化。回顾分析一个大型试点，这是试点的患者没有已知的心血管疾病他汀类药物治疗史，结果显示，发生下降的这些患者LDL水平低于中值，而CRP水平高于中值，类似于接受治理的这些LDL水平高于中值55。
这些注意事项激发了Paul M Ridker博士设计并进行了著名的大型临床试点JUPITER(Justification for the Use of Statins in Prevention: an Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin，使用他汀类药物预防的理由：一种对Rosuvastatin他汀干预试验评估)。这项试验涉及17000名人员，这些人没有已知的心血管疾病，hsCRP >2 mg/L，低密度脂蛋白胆固醇水平<130 mg/dL。研究发现，在他汀类药物治疗后，首次发生心血管疾病的发生率下降＞40%。研究还发现，他汀组死亡率也下降了，尽管本研究没有涉及死亡率的研究。JUPITER试验结果分析表明，临床受益均来自于LDL的降低和CRP抗炎反应的降低57。这些表面健康人群的结果与先前临床急性冠状动脉综合征幸存者的研究结果一致。
JUPITER不是为了证明，也不可能证明一种直接的抗炎疗法能减少动脉粥样硬化的发生。检验这一假设将需要更多的临床试验，目前，这些调查正在进行或规划阶段。Canakinumab抗血栓研究(CANTOS)将测试注射抗体中和促炎细胞因子IL-1β是否能降低心肌梗塞患者心血管事件的发生，这些患者hsCRP水平持续超过2毫克/升，尽管标准护理疗法包含超剂量他汀类药物治疗58。心血管炎症减少试验（Cardiovascular Inflammation Reduction Trial ，CIRT）将对相似的群体每周低剂量服用甲氨蝶呤（一种在治疗类风湿性关节炎中的成功给药方案），测试是否能降低心血管疾病的反复发作59。在适应性免疫领域，人们正在探索接种氧化LDL-衍生的抗原以引发体液免疫应答，用来保护机体免受动脉粥样硬化困扰的可行性60。这些研究应当允许干扰的存在，将有利于提升结果的可靠性，如先天性和后天性免疫、动脉粥样硬化过程中炎症周期中断。复杂因素和多余的介质以及参与血管炎症的信号传导途径，动脉粥样硬化的这些炎症假说的临床验证可能需要测试若干目标，以发现疾病在未过度损害机体防御时的介入最佳点。
结论
在19世纪发现的炎症促进动脉粥样硬化的理念，最近十年又重新燃起了研究的热潮。生物学和临床研究的新工具已经确立了炎症反应和免疫的试验性动脉粥样硬化的作用。这些在人体上的概念与转移到临床实践中的验证性工作正在进行中。炎症参与动脉粥样硬化的新认识及其并发症挑战了传统的风险因素（如高水平LDL），成为动脉粥样硬化致病的危险因素（图3）。的确，由传统风险因素导致的炎症反应及其并发症，改变动脉壁形成动脉粥样硬化提供了机理上的生物学途径。未来几年，炎症反应在动脉粥样硬化中的作用的研究将不断完善，并将应用这些研究服务于人类健康。

图3. 传统风险因素与炎症反应在动脉粥样硬化中的关系。动脉粥样硬化中炎症反应的概念绝不会降低传统风险因素对动脉粥样硬化的重要性，图中顶部，包括LDL和血管紧张素II（angiotensin II ，Ang II）。相反，炎症信号的概念和促炎细胞因子的参与提供了推动动脉粥样硬化及其并发症的传统危险因素和动脉壁的改变生物反应之间的关联机制。
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