微生物学微生物与基因工程.pptx
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1、第八章微生物与基因工程第一节微生物与基因工程的关系第二节基因工程的基本过程基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造,插入载体中,导入宿主细胞内,使其扩增和表达,从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。l基因工程是一种基因工程是一种DNA 的体外重组技术,是的体外重组技术,是根据人们的需要,在分子水平上用人工方法根据人们的需要,在分子水平上用人工方法取得供体取得供体 DNA上的基因,在体外重组于载体上的基因,在体外重组于载体DNA上,再移入原体细胞,使转录翻译及复上,再移入原
2、体细胞,使转录翻译及复制,表达出供体基因原有的生物学特性。制,表达出供体基因原有的生物学特性。l这种使这种使 DNA分子进行重组,再在受体分子进行重组,再在受体细胞内无性繁殖的技术也被称为分子无细胞内无性繁殖的技术也被称为分子无性繁殖或分子克隆、性繁殖或分子克隆、重组重组DNA技术技术。l 通过基因工程改造后的菌株被称为通过基因工程改造后的菌株被称为“工程菌工程菌”。基因工程是一门崭新的生物技基因工程是一门崭新的生物技术。它的出现标志着人类已经术。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基能够按照自己意愿进行各种基因操作,大规模生产基因产物,因操作,大规模生产基因产物,并可设计和创建新的
3、蛋白质和并可设计和创建新的蛋白质和新的生物物种。新的生物物种。DNA的特异切割、DNA分子克隆、DNA快速测序这三项技术的建立为基因工程奠定了基础。第一节微生物与基因工程的关系微生物与基因工程的关系密切,基因工程的产物和发展依赖于微生物学的理论和技术。微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。可以说一切基因工程操作都离不开微生物。基因工程所用载体不是微生物就是微生物的质粒。基因工程所用的千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。微生物细胞是基因工程中基因克隆的宿主,即使是植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体,使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改
4、造,才能再转移到植物或动物细胞中。微生物和微生物学在基因工程中的重要性微生物和微生物学在基因工程中的重要性为了大规模表达各种基因产物,从事商业化生产,通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或者是酵母菌中以构建工程菌,利用工厂发酵来实现。微生物的多样性,尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因,为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源。有关基因的结构、性质和表达调控的理论主要是从微生物的研究中取得的,或者是将动物、植物基因转移到微生物中后研究而获得的。一、微生物与克隆载体克隆载体(cloning vector):外源DNA片段进行克隆,需要一个合适的载体将其运送到细胞中并进行复制和扩增。这种以扩增外
5、源基因为目的的载体称为克隆载体。l把把一一个个有有用用的的目目的的DNA片片段段通通过过重重组组DNA技技术术,送送进进受受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(vector)。)。作为克隆载体的条件是:载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制,因此载体应是一个复制子;载体必须具有若干个限制酶的单一切割位点,便于外源基因的插入。并且这些酶切位点应位于载体复制的非必要去,故插入适当大小外源DNA片段后载体仍能进行正常的复制。载体必须具有可供选择的遗传标记。如抗生素的抗性基因等。l基基因因工工程程中中使使用用的的载载体体基基本本上上均均来来自自微生物,主要包括微
6、生物,主要包括6大类:大类:l质粒载体;质粒载体;l噬菌体载体;噬菌体载体;l柯斯质粒载体;柯斯质粒载体;lM13噬菌体载体;噬菌体载体;l真核细胞的克隆载体;真核细胞的克隆载体;l人工染色体等。人工染色体等。载体的选择载体的选择 l1)是一个有自我复制能力的复制子()是一个有自我复制能力的复制子(replicon)l2)能在受体细胞内大量增殖,即有较高的复制率。能在受体细胞内大量增殖,即有较高的复制率。l3)载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口,使目载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。的一定位置上。l4)载体上
7、必须有一种选择遗传标记,以便及时将载体上必须有一种选择遗传标记,以便及时将“工程工程菌菌”选择出来。选择出来。1 1、质粒克隆载体、质粒克隆载体l(1)、质粒载体)、质粒载体l质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性:具有独立复制起点;具有较小的相对分子质量,一般不超过15kb;具有较高拷贝数,使外源DNA得以大量扩增;易于导入细胞;具有便于选择的标记和具有安全性。2、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体l噬噬菌菌体体克克隆隆载载体体是是基基因因工工程程中中一一类类很很有有价价值值的的克克隆隆载载体体,具具有有很很多多优优点点:其其分分子子遗遗传传学学背背景景十
8、十分分清清楚楚;载载体体容容量量较较大大,一一般般质质粒粒载载体体只只能能容容纳纳10多多个个kb,而而噬噬菌菌体体载载体体却却能能容容纳纳大大约约23kb的的外外源源DNA片片段段;具具有有较较高高的的感感染染效效率率,其其感感染染宿宿主主细细胞胞的的效效率率几几乎乎可可达达100%,而而质质粒粒DNA的的转转化化率率却却只有只有0.1%。l但但野野生生型型噬噬菌菌体体DNA的的分分子子很很大大,基基因因结结构构复复杂杂,限限制制酶酶有有很很多多切切点点,且且这这些些切切点点多多数数位位于于必必需需基基因因之之中中,因因而而不不适适于作为克隆载体,必需经一系列改造才能用作克隆载体。于作为克隆
9、载体,必需经一系列改造才能用作克隆载体。l构建构建噬菌体载体克隆载体的基本原则是:噬菌体载体克隆载体的基本原则是:删删除除基基因因组组中中非非必必需需区区,使使基基因因组组变变小小,有有利利于于克克隆隆较较大的大的DNA片段;片段;除去多余的限制位点。除去多余的限制位点。3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体l 柯柯斯斯质质粒粒载载体体(cosmid vector)即即粘粘粒粒载载体体,是是由由噬噬菌菌体体的的粘粘性性末末端端和和质质粒粒构构建建而而成成。柯柯斯斯质质粒粒载载体体含含有有来来自自质质粒粒的的一一个个复复制制起起点点、抗抗药药性性标标记记、一一个个或或多多个个限限制制酶酶单单一一位位
10、点点,以以及及来来自自噬噬菌菌体体粘粘性性末末端端的的DNA片片段段,即即cos位位点点,其其对对于于将将DNA包装成包装成噬菌体粒子是必需的。噬菌体粒子是必需的。l 柯斯质粒载体的优点:柯斯质粒载体的优点:具有噬菌体的高效感染力,而在进入宿主细胞后不形成子具有噬菌体的高效感染力,而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在;代噬菌体仅以质粒形式存在;具有质粒具有质粒DNA的复制方式,重组的复制方式,重组DNA注入宿主细胞后,两注入宿主细胞后,两个个cos位点连接形成环状位点连接形成环状DNA分子,如同质粒一样进行复制;分子,如同质粒一样进行复制;具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源DN
11、A的能力,柯斯质粒本身一般只有的能力,柯斯质粒本身一般只有57kb左右,而它可克隆外源左右,而它可克隆外源DNA片段的极度限值竟高达片段的极度限值竟高达45kb,远远超过质粒载体及,远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。噬菌体载体的克隆能力。4、M13噬菌体载体噬菌体载体lM13是是大大肠肠杆杆菌菌丝丝状状噬噬菌菌体体,其其基基因因组组为为环环状状ssDNA,大大小小为为6 407bp。感感染染雄雄性性(F+或或Hfr)大大肠肠杆杆菌菌并并进进入入细细胞胞后后转转变变成成复复制制型型(RF)dsDNA,然然后后以以滚滚环环方方式式复复制制出出ssDNA。每每当当复复制制出出单单位位长长度度正
12、正链链,即即被被切切出出和和环环化化,并并立立即即组组装装成成子子代代噬噬菌菌体体和和以以出出芽芽方方式式(即即宿宿主主细细胞胞不被裂解)释放至胞外。不被裂解)释放至胞外。l 野生型野生型M13不适于直接作为克隆载体,因此人们对其进不适于直接作为克隆载体,因此人们对其进行改造,构建了一系列行改造,构建了一系列M13克隆载体。克隆载体。5 5、噬菌体质粒载体、噬菌体质粒载体l 噬噬菌菌体体质质粒粒(phagemid或或phasmid)是是由由丝丝状状噬噬菌菌体体和和质质粒粒载载体体DNA融融合合而而成成,兼兼有有两两者者优优点点,这这类类载载体体具具有有来来自自M13或或f1噬噬菌菌体体的的基基
13、因因间间隔隔区区(内内含含M13或或f1噬噬菌菌体体复复制制起起点点)和和来来自自质质粒粒的的复复制制起起点点、抗抗药药性性标标记记、一一个个多克隆位点区等。多克隆位点区等。l噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点:噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点:载体本身分子小,约为载体本身分子小,约为3 000bp3 000bp,便于分离和操作;,便于分离和操作;克克隆隆外外源源DNADNA容容量量较较M M1313噬噬菌菌体体载载体体大大,可可克克隆隆10kb10kb外外源源DNADNA片段;片段;可用于制备单链或双链可用于制备单链或双链DNADNA,克隆和表达外源基因。,克隆和表达外源基因。6 6、真核
14、生物的克隆载体、真核生物的克隆载体l真核生物载体,主要有以下几大类:l(1)、酵母质粒载体)、酵母质粒载体、附加体质粒(、附加体质粒(epislmal plasmid)、复制质粒(、复制质粒(replicating plasmid)、整合质粒(、整合质粒(integrating plasmid)l(2)、真核生物病毒载体)、真核生物病毒载体、哺乳动物病毒载体、哺乳动物病毒载体、昆虫病毒载体、昆虫病毒载体、植物病毒载体、植物病毒载体7 7、人工染色体、人工染色体l酵酵母母人人工工染染色色体体(yeast artificial chromosome,YAC)是一类目前能容纳最大外源是一类目前能容纳
15、最大外源DNA片段人工构建的载体。片段人工构建的载体。l酵母染色体的控制系统主要包括三部分:酵母染色体的控制系统主要包括三部分:着着丝丝粒粒(centromere,CEN),它它的的作作用用是是使使染染色色体体的的附附着着粒粒与与有有丝丝分分裂裂的的纺纺锤锤丝丝相相连连,保保证证染染色色体体在在细细胞胞分裂过程中正确分配到子代细胞;分裂过程中正确分配到子代细胞;端端粒粒(telomere,TEL),位位于于染染色色体体两两个个末末端端,功功能能是是保保护护染染色色体体两两端端,保保证证染染色色体体的的正正常常复复制制,防防止止染染色色体体DNA复制过程中两端序列的丢失;复制过程中两端序列的丢失
16、;酵酵母母自自主主复复制制序序列列(autonomously replicating sequence,ARS)其功能与酵母细胞复制有关。)其功能与酵母细胞复制有关。表达载体的构建表达载体的构建l 基基因因工工程程的的主主要要目目的的是是使使外外源源基基因因能能在在细细菌菌、酵酵母母或或动动、植植物物细细胞胞中中得得到到高高效效表表达达,以以便便获获得得大大量量有有益益的的基基因因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。l所所谓谓表表达达载载体体(expression vector)是是指指宿宿主主细细胞胞基基因因表表达达所所需需调调节节控控制制序序
17、列列,能能使使克克隆隆的的基基因因在在宿宿主主细细胞胞内内转转录录和和翻翻译译的的载载体体。也也即即克克隆隆载载体体只只是是携携带带外外源源基基因因,使使其其在在宿宿主主细细胞胞内内扩扩增增;表表达达载载体体不不仅仅可可使使外外源源基基因因扩扩增增,还还可可使使其其表表达达。原原核核生生物物和和真真核核生生物物的的表表达达载载体体有有一一些些共共同同的的要要求求,但但两两者者的的基基因因表表达达调调控控机机制制有有很很大大不不同同,故故需需要要分分别别采采用用原原核生物和真核生物的调控原件来构建。核生物和真核生物的调控原件来构建。1 1、表达系统的要求与主要调控元件、表达系统的要求与主要调控元
18、件l表达系统的要求与主要调控元件包括:表达系统的要求与主要调控元件包括:启动子、启动子、核糖体的结合位点、核糖体的结合位点、转录终止信号转录终止信号 密码子偏爱性密码子偏爱性 等。等。2 2、表达载体中调节开关的作用、表达载体中调节开关的作用l通通常常表表达达载载体体不不应应使使外外源源基基因因始始终终处处于于转转录录和和翻翻译译之之中中。这这是是由由于于某某些些有有价价值值的的外外源源蛋蛋白白可可能能对对宿宿主主细细胞胞是是有有毒毒的的,外外源源蛋蛋白白的的过过量量表表达达必必将将影影响响细细胞胞生生长长;此此外外某某些些载载体体的的启启动动子子是是强强启启动动子子,如如T7启启动动子子,强
19、强启启动动子子的的表表达达非非常常强强以以致致使使正正常常宿宿主主基基因因不不能表达。能表达。l基基于于以以上上事事实实,宿宿主主细细胞胞的的生生长长和和外外源源基基因因的的表表达达应应该该分分成成两两个个阶阶段段进进行行。第第一一阶阶段段使使含含有有外外源源基基因因的的宿宿主主细细胞胞迅迅速速生生长长直直至至获获得得足足够够量量的的细细胞胞。第第二二阶阶段段是是启启动动开开关关,使使所所有有细细胞胞外外源基因同时高效表达,产生大量有价值的表达产物。源基因同时高效表达,产生大量有价值的表达产物。l在在原原核核基基因因表表达达调调控控中中,阻阻遏遏蛋蛋白白操操纵纵基基因因系系统统起起着着重重要要
20、调调节节开开关关的的作作用用。当当阻阻遏遏蛋蛋白白与与操操纵纵基基因因相相结结合合时时,能能够够阻阻止止基基因因的的转转录录。加加入入诱诱导导物物,使使其其与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合,解解除除阻阻遏遏,从从而而启启动基因转录。动基因转录。二、微生物与基因工程工具酶基因工程所用的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化获得的。l对DNA片段进行操作,必须要有能“切短”DNA的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的DNA片段进行切割拼接组装。l在分离目的基因或切割载体时,需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时,需要DNA连接酶催化,使目的DNA片段与载体DNA进行
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