微生物学大实验终稿.pptx
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1、实验流程土壤样品中微生物的分离纯化细菌酵母菌霉菌放线菌形态结构观察生理生化反应nisin效价测定生长曲线测定形态观察死活细胞鉴定直接计数测微技术形态结构观察培养菌种保藏土壤中微生物的分离纯化、培养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏观察及保藏相关理论知识(1)l微生物的分离与纯化 从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。l常用的分离、纯化方法 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落,通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养
2、观察及保藏相关理论知识(2)l土壤生境 土壤是微生物生活的大本营,所含微生物无论数量还是种类都极其丰富,因此,土壤是微生物多样性生长的重要场所,是发掘微生物资源的重要基地,可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏相关理论知识(3)l乳酸菌 乳酸菌是一类能在碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌,在酸奶中大量存在。l乳酸菌形态 球形、类球状、短杆或杆状,有些细胞有芽孢。l代谢产物 以乳酸为主要代谢产物,有些乳酸菌可以产生乳链菌肽(Nisin),乳链菌肽有抑菌活性。土壤
3、中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理。2、掌握常用的分离纯化微生物的方法。3、掌握倒平板的方法。4、进一步熟练和掌握微生物的无菌操技术。5、掌握微生物的培养方法。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏实验原理(1)l微生物分离与纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。l平板分离法 普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件(如营养成分、酸碱度、温度和氧等,或加入某种抑制剂),在平板上培养微生物,当平板上长出单菌落后,挑取,得到纯种的微
4、生物 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏实验原理(2)l分离产Nisin的乳酸乳球菌时,要用选择性平板 能够产生Nisin的乳酸菌,自身会有对一定浓度的Nisin 的抗性,而很多其它的细菌不具有这种抗性。所以,在纯化乳酸乳球菌时,要在平板中加入一定量的Nisin,使得对Nisin没有抗性的其它细菌被抑制,平板中的单菌落就有更大的可能性是我们需要的乳酸乳球菌l采用在平板中加入抑制剂的方法是微生物学常用的分离纯化微生物的方法。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏试剂与器材1、材料 含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、根
5、霉、青霉和放线菌的土壤样品及酸奶样品,牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体)、马丁氏培养基、查氏培养基等2、试剂 10%酚、4%水琼脂3、器材 盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、涂布器、无菌吸管、接种环,酒精灯、无菌培养皿、显微镜、细胞计数板等。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏牛肉膏蛋白胨培养基l牛肉膏 3gl蛋白胨 10glNaCl 5gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mllpH 7.0-7.2l用于分离细菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏查氏培养基lNaNO3 2g
6、lK2HPO4 1glKCl 0.5glMgSO4 0.5glFeSO4 0.01gl蔗糖 30gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mll用于分离霉菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏高氏一号培养基l可溶淀粉 20glKNO3 1glNaCl 0.5glK2HPO4 0.5glMgSO4 0.5glFeSO4 0.01gl琼脂 15-20gl用水定容至 1000mllpH 7.2-7.4l用于分离放线菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏马丁氏培养基l葡萄糖 10gl 蛋白胨 5gl K2HPO4 1gl
7、 MgSO4 0.5gl FeSO4 0.01gl pH 自然l 用水定容至 800mll 用于分离酵母菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏M17培养基l蛋白胨10 gl酵母粉5 gl抗坏血酸0.5 gl牛肉膏2.5 glMgSO47H2O0.01 gl磷酸氢二钠19 g l0.04%溴甲酚紫16mll用水定容至 1000ml l乳链菌肽(Nisin)250ml Nisin/1000ml培养基(Nisin单独灭菌)l用于分离酸奶中的乳酸乳球菌 l从酸奶中分离乳酸乳球菌的操作与从土壤中分离细菌操作相同 土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的
8、分离纯化、培养观察及保藏实验步骤土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏 倒平板土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏菌悬液的配制土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏菌液的稀释土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏接 种土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏培 养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏微生物的纯种培养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分
9、离纯化、培养观察及保藏注意事项1、接种环要灼烧灭菌。接触菌体前要冷却。接种后要在火焰上灼烧。2、实验在洁净工作台内进行,操作时菌体不 应和火焰太过接近。3、本实验要严格地按照无菌操作进行。4、培养时要倒置培养,防止染菌。5、取单菌落时不要碰到其它的菌落。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察相关理论知识l细菌形态群体的形态 细菌菌落大多表面光滑湿润,有光泽,一般菌落较小,质地颜色均匀,同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。个体的形态 主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类
10、,近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态随培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌个体微小,较透明,必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求,可将染色分为简单染色、鉴别染色、特殊染色三种类型。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察目的要求1、显微镜下观察细菌个体的形态。2、学习环境中微生物的检查方法,并加深对微生物 分布广泛性的认识。3、了解简单染色法的原理,并掌握其操作方法4、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌 操作技术。5、巩固显微镜的油镜的使用方法。6、初步认识细菌的形态。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察简单染色法原理 简单染色是利用单一染料对细菌
11、进行染色。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常带负电荷,碱性染料(解离时分子的染色部分带正电荷)如美兰、结晶紫等易与细菌结合使其着色。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察试剂与器材1、材料 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及乳酸乳球球菌2、试剂 吕氏碱性美蓝染液或草酸铵结晶紫染液3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶(内 装香柏油及二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察实验步骤l涂片l干燥:室温自然干燥l固定:通过火焰23次,细胞质凝固l染色:滴加染液l冲洗:水洗至无色l干燥:自然,吹干,吸干l镜检细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察注意事项l涂片时水滴不要太大,
12、菌体最好涂成一个薄膜。要求涂布均匀。l室温自然干燥。l固定时,通过火焰23次,不可以加热过久。l染色时,滴加染液覆盖上菌体薄膜即可。l冲洗时,水洗至无色,要注意水流要有一个角度,从载片的一端自然流到另一端,但是水流要通过染色过的菌体薄膜。水流不宜过大,防止将菌体冲走。l镜检时,油镜与普通的物镜要严格地按照操作规程执行。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色相关理论知识l革兰氏染色法 它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师Gram创立。l菌种鉴定的重要手段 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类,它是细菌
13、学上最常用的鉴别染色法。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色目的要求1、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法 步骤。2、学习并掌握芽孢染色法3、掌握革兰氏染色法的原理。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色革兰氏染色实验原理 革兰氏染色能将细菌分为G+菌和G-菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后变成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性
14、降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色试剂与器材1、材料 乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌。2、试剂 结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶(内 装香柏油及二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色革兰氏染色实验步骤l制片:取菌种培养液常规涂片,干燥,固定。l初染:滴加结晶紫,染色12min,水洗;l媒染:用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗;l乙醇脱色:滤纸吸去残水,倾斜玻片用95乙醇 洗涤脱色至无色,立即水洗;l复染:番红液复染约2min,水洗;l镜检:革兰氏阳性菌(蓝紫色);革兰氏阴性菌 (红
15、色)细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色实验结果(1)革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色炭疽杆菌的革兰氏染色炭疽杆菌的革兰氏染色 革兰氏染色可见大量细菌革兰氏染色可见大量细菌 革兰氏染色后在显微镜下观察革兰氏染色后在显微镜下观察 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色染色显示染色显示革兰氏阳性阴性细菌革兰氏阳性阴性细菌细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色注意事项1.涂片务求均匀,切忌过厚。2在染色过程中,不可使染液干涸。火焰固定不 宜过热。3脱色时间十分重要,过长,则脱色过度,会使阳 性菌被染成阴性菌;脱色不够,则会使阴性菌被 染成阳性菌。4不能选用老龄菌。细菌
16、的革兰氏染色细菌的革兰氏染色细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应相关理论知识(1)l 微生物分类学(microbialtaonomy)它是一门按微生物的等级关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群(taxon)的科学。它具体的任务是分类(classificontion)、鉴定(indentification)和命名(namendature)。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应l微生物的七级分类单位 号(kingdom)(拉:Regnum)门(Phylum)(拉:Phylum)或Division(拉:Divisio)纲(class)(拉:classis)目(order)(
17、拉:order)科(Family)(拉:Family)属(Genus)(拉:Genus)种(Species)(拉:Species)细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应l种的概念亚种(Subspecies,subsp.,SSP.)变种(Variety,Var.)型(form)类群(group)菌株(strain)细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应相关理论知识(2)l微生物的分类系统 原核生物分类系统(细菌、放线菌、蓝细菌,支原体、衣原体、立克次氏体等)伯杰氏细菌鉴定手册(BergeysManualofDeterminativeBacteriology)(1923-1974的1-
18、8版)伯杰氏系统细菌学手册(BergeysManualofsystematicBocteriology,1984)真菌的分类系统(酵母菌、霉菌、食用真菌、原生动物、藻类等)Ainswerth(1973)的分类系统。(AinsuorthandBisbys的真菌学辞典DictionaryoftheFungi,Sixth.edition,1971)细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应相关理论知识(3)l微生物的鉴定获得该微生物的纯种培养物(pureculture);测定一系列必要的鉴定指标;查找权威性的鉴定手册。l经典分类鉴定方法 形态;生理、生化反应;生态特性;生活史特点;血清学反应(免疫
19、学鉴定);噬菌体的敏感性等l现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定 细胞化学成分的鉴定 细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应目的要求1、不同微生物对各种有机分子水解能力不同,说明 不同微生物有不同的酶系统。2、掌握微生物大分子水解实验的原理及方法。3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。4、测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物 的能力。5、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验 原理和方法。6、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利 用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。7、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物 在鉴别细菌中的意义。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生
20、理生化反应实验原理(1)各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同,所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们有不同的酶系统。细菌生化反应的多样性在自然界产生了两种结果:第一、使自然界所有的有机分子都可以分解;第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础,例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应实验原理(2)微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水
21、解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。代谢过程中产酸(乳酸、醋酸、丙 酸)和/或产气(H2,CH4,CO2);酸用指示剂检测;气通过倒置的德汉氏小管或直接观察。有些细菌含有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色,不能直接看见,但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时,该试剂与吲哚作用,形成红色的玫瑰吲哚。某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生
22、成红色化合物,称VP(+)反应。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应实验原理(3)不同细菌利用柠檬酸盐能力不同,有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源,有的则不能。某些细菌将柠檬酸盐分解为二氧化碳,培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠,是培养基碱性增加。根据培养基中指示剂变色来判断实验结果。指示剂可用溴麝香草酚蓝(pH6 呈黄色,pH 6-7.6呈绿色,pH7.6呈蓝色)。有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢,硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐,可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀,从而可确定硫化氢的产生。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应多糖的水解细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应吲
23、哚实验1细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应吲哚实验2细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应伏普实验细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应试剂与器材1、材料 乳酸乳球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、固体淀粉培养基。2、试剂 甲基红试剂、40%氢氧化钾、5%-萘酚、乙醚、吲哚试剂。3、器材 德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱、高压灭菌器等。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应淀粉固体培养基l可溶性淀粉 2gl牛肉膏 5gl蛋白胨 10glNaCl 5gl琼脂 15gl水 1000mllpH 自然l倒平板l水解淀粉实验细
24、菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应葡萄糖发酵培养基lK2PO4 1gl葡萄糖 10gl蛋白胨 5gl琼脂 5gl溴甲酚紫 15mll水 1000mllpH 7.0-7.2l分装试管(4-5cm)垂直冷却l3个试管l糖发酵实验细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应蛋白胨水培养基l蛋白胨 5glNaCl 5gl水 1000mll分装试管(4-5cm)l3个试管l吲哚实验细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应葡萄糖蛋白胨水培养基l葡萄糖 5gl蛋白胨 5glNaCl 5gl水 1000mllpH 7.0-7.2l分装试管(4-5cm)l3个试管l伏普实验细菌细胞的生理生化反应细菌
25、细胞的生理生化反应淀粉的水解实验1、固体淀粉培养基灭菌后冷却至50,倒平板;2、记号笔将平板分区,不同的区域接种不同的菌种,记录接种的菌种名;3、平板倒置在37培养24h;4、将平板打开,加入Lugols碘液,轻旋转,观察结果。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应糖发酵实验l实验步骤 取半固体葡萄糖发酵培养基试管支,分别用接种针穿刺接入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和阴性对照,37 培养24h。l观察记录 与对照管比较,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该种糖,记录用“”表示;如培养液呈黄色,反应结果为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸,记录用“”表示。培养液中有气泡为阳
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- 微生物学 实验
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