微生物实验.pptx

微生物定义微生物特点 1.形态小 2.种类多，分布广 3.生长速度快，繁殖能力强 4.容易变异微生物在自然界的作用微生物学的分科分类单位：界，门，纲，目，科，属，种。微生物研究发展经验形态生理生化分子生物学微生物分类微生物在生物界得分类地位生物界 有细胞结构1动物界 2植物界 3真核原生生物界 4真菌界 5原核生物界 无细胞结构-病毒界 原核生物界（原核细胞型生物）古细菌细菌放线菌螺旋体支原体立克次体衣原体微生物的分类单位界、门、纲、目、科、属、种变种、型、菌株菌株 是指不同来源的相同的种（型）的微生物 具有典型特征的菌株称为标准菌株细菌历史细菌这个名词最初由德国科学家埃伦伯格（ChristianGottfriedEhrenberg，1795-1876）在1828年提出，用来指代某种细菌。这个词来源于希腊语，意为“小棍子”。1866年，德国动物学家海克尔（ErnstHaeckel，1834-1919）建议使用“原生生物”，包括所有单细胞生物（细菌、藻类、真菌和原生动物）。1878年，法国外科医生塞迪悦（CharlesEmmanuelSedillot，1804-1883）提出“微生物”来描述细菌细胞或者更普遍的用来指微小生物体。因为细菌是单细胞微生物，用肉眼无法看见，需要用显微镜来观察。1683年，列文虎克（AntonyvanLeeuwenhoek，16321723）最先使用自己设计的单透镜显微镜观察到了细菌，大概放大200倍。路易。巴斯德（LouisPasteur，1822-1895）和罗伯特。科赫（RobertKoch，1843-1910）指出细菌可导致疾病。细菌的分类方式和结构细菌可以按照不同的方式分类。细菌具有不同的形状。大部分细菌是如下三类：杆菌是棒状；球菌是球形（例如链球菌或葡萄球菌）；螺旋菌是螺旋形（弧菌，是逗号形，螺菌菌体有数个弯曲。）细菌的结构十分简单，原核生物，没有膜结构的细胞器例如线粒体和叶绿体，但是有细胞壁。根据细胞壁的组成成分，细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。“革兰氏”来源于丹麦细菌学家革兰（Hans Christian Gram），他发明了革兰氏染色。有些细菌细胞壁外有多糖形成的荚膜，形成了一层遮盖物或包膜。荚膜可以帮助细菌在干旱季节处于休眠状态，并能储存食物和处理废物革兰氏染色革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。医学教.育网搜集整理复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番细菌的繁殖细菌可以以无性或者遗传重组两种方式繁殖，最主要的方式是以二分裂法这种无性繁殖的方式：一个细菌细胞细胞壁横向分裂，形成两个子代细胞。并且单个细胞也会通过如下几种方式发生遗传变异：突变（细胞自身的遗传密码发生随机改变），转化（无修饰的DNA从一个细菌转移到溶液中另一个细菌中），转染（病毒的或细菌的DNA，或者两者的DNA，通过噬菌体转移到另一个细菌中），细菌（一个细菌的DNA通过两细菌间形成的特殊的蛋白质结构，接合菌毛，转移到另一个细菌）。细菌可以通过这些方式获得DNA，然后进行分裂，将重组的基因组传给后代。许多细菌都含有包含染色体外DNA的质粒。处于有利环境中时，细菌可以形成肉眼可见的集合体，例如菌簇细菌的繁殖条件1.充足的营养：充足的营养：必须有充足的营养物质才能为细菌的新陈代谢及生长繁殖提供必需的原料和足够的能量。2.适宜的温度：适宜的温度：细胞生长的温度极限为-790。各类细菌对温度的要求不同，可分为嗜冷菌，最适生长温度为（1020）；嗜温菌，2040；嗜热菌，在高至5660生长最好。病原菌均为嗜温菌，最适温度为人体的体温，即37，故实验室一般采用37培养细菌。有些嗜温菌低温下也可生长繁殖，如5冰箱内，金黄色葡萄球菌缓慢生长释放毒素，故食用过夜冰箱冷存食物，可致食物中毒。3.合适的酸碱度：合适的酸碱度：在细菌的新陈代谢过程中，酶的活性在一定的PH范围才能发挥。多数病原菌最适PH为中性或弱碱性（pH7.27.6）。人类血液、组织液PH为7.4，细菌极易生存。胃液偏酸，绝大从数细菌可被杀死。个别细菌在碱性条件下生长良好，如霍乱孤菌在PH8.49.2时生长最好；也有的细菌最适pH偏酸，如结核杆菌（pH6.56.8）、乳本乡杆菌（pH5.5）。细菌代谢过程中分解糖产酸，PH下降，影响细菌生长，所以培养基中应加入缓冲剂，保持PH稳定。4.必要的气体环境：必要的气体环境：氧的存大与否和生长有关，有些细菌仅能在有氧条件下生长；有的只能在无氧环境下生长；而大多数病原菌在有氧及无氧的条件下均能生存。一般细菌代谢中都需CO2，但大多数细菌自身代谢所产生的CO2即可满足需要。有些细菌，如脑膜炎双球菌在初次分离时需要较高浓度的CO2（510%），否则生长很差甚至不能生长菌种保存1.细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。2.细菌保存于含有甘油的培养物中：（1）在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇干冰或液氮中冻结后再转至70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。（2）在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30%灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库细菌计数1、计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。、计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的（O.1mm3），因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。2、电子计数器计数法：电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，、电子计数器计数法：电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确医学教.育网搜集整理；为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑（TTC）；本法限用于形成菌落的微生物。广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度（OD值）表示样品菌液浓度。此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。6、测定细胞总氮量或总碳量氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。、测定细胞总氮量或总碳量氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。7、颜色改变单位法（、颜色改变单位法（CCU）这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作：（1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。（2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管（3）于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满细菌形态(一一)细菌的测量单位细菌的测量单位微米微米(二二)细菌的形态细菌的形态分为球菌、杆菌和螺形菌三种形态。分为球菌、杆菌和螺形菌三种形态。1球菌包括球形、肾形、豆状、矛头状等多种，直径球菌包括球形、肾形、豆状、矛头状等多种，直径0812微米，呈双球状、链状、葡萄状等多种排列形式。微米，呈双球状、链状、葡萄状等多种排列形式。2杆菌种类繁多，长短粗细差异较大，有杆状、球杆状、棒状杆菌种类繁多，长短粗细差异较大，有杆状、球杆状、棒状及梭状等，并有链杆状、分枝状、栅栏状等多种排列形式。及梭状等，并有链杆状、分枝状、栅栏状等多种排列形式。3螺形菌分为：螺形菌分为：弧菌，为弧状或逗点状，只有一个弯曲，如弧菌，为弧状或逗点状，只有一个弯曲，如霍乱弧菌；霍乱弧菌；螺菌，菌体由两个以上弯曲，长螺菌，菌体由两个以上弯曲，长36微米，如鼠咬热螺微米，如鼠咬热螺菌；菌；螺杆菌，呈螺旋状弯曲，长螺杆菌，呈螺旋状弯曲，长2.54.0微米，如幽门螺杆菌微米，如幽门螺杆菌弯弯曲菌，呈曲菌，呈U形、形、S形等，如空肠弯曲菌及大肠弯曲菌形等，如空肠弯曲菌及大肠弯曲菌细菌基本结构细菌基本结构的构成如下：1.细胞壁：细胞壁为包绕在细胞膜外的膜状结构，厚l080纳米，其组成较复杂，因不同细菌而异，主要成分为肽聚糖等，其主要功能为保持菌体固有形态和维持菌体内外的渗透压。2.细胞膜：细胞膜为包裹细胞质的结构，厚约7.5nm，与真核细胞膜相比，不含胆固醇，但均具有细胞内外物质转运，分泌及呼吸功能，并与细菌的代谢及致病性密切相关；参与细菌结构（如肽聚糖、鞭毛和荚膜等）的生物合成；形成中介体（参与细菌分裂繁殖）等功能。3.细胞质：细胞质位于菌体内部的原生质，内含核糖体、质粒、胞质颗粒等多种重要结构。4.核质：核质是由细胞质内的细菌本身的遗传物质DNA和RNA聚集而成，因为无核膜，不具备完整的核结构，故亦称为拟核细菌的特殊结构细菌的特殊结构包括荚膜、鞭毛、菌毛及芽孢（胞）。为某些细菌所缺乏，而为某些细菌所特有的结构。（一）荚膜及其与细菌致病性的关系荚膜菌在其细胞壁外有一层厚0.2nm黏稠结构称为荚膜，其化学成分在多数菌为多糖。少数菌为多肽。荚膜具有黏附宿主细胞和抗吞噬等致病作用以及抗原性，并且是鉴别细菌的指征之一。（二）鞭毛及其与医学的关系弧菌、螺菌、占半数的杆菌及少数球菌，由细胞膜伸出菌体外细长的蛋白性丝状体，称为鞭毛。根据鞭毛菌上鞭毛位置和数量，分为单毛菌、双毛菌、丛毛菌和周毛菌。鞭毛是运动器，它使鞭毛菌趋向营养物质而逃避有害物质，且具有抗原性并与致病性有关，例如沙门氏菌的鞭毛抗原即H抗原，具有使菌体穿透肠黏液层侵及肠黏膜上皮细胞的功能。（三）菌毛的定义、分类及其与医学的关系1.菌毛许多革兰氏阴性（G-）菌及少数革兰氏阳性（G+）菌在其菌体表面有细而短、多而直的蛋白性丝状体，称为菌毛。2.菌毛的分类菌毛分为普通菌毛和性菌毛两类：普通菌毛，数量多，每菌可达数百根，短而直，直径38nm，长0.22微米性菌毛亦称F菌毛，每菌仅有110根，粗而长、中空呈管状，它由F质粒表达。性菌毛菌称为F+菌。3.菌毛与医学的关系普通菌毛可促使细菌黏附于宿主细胞表面而致病。F+菌的菌体内质粒或染色体DNA，通过中空的性菌毛与F菌表面相应的受体接合（conjugation），可将遗传信息，如细菌毒力、耐药性及耐热性等，传递给F.受体菌，使之获得新的遗传性状。此外，性菌毛也是某些噬菌体的受体，使噬菌体吸附于F-菌，并使后者获取致病物质，如霍乱弧菌获取霍乱肠毒素。（四）芽孢（胞）及其与医学的关系需氧芽孢（胞）杆菌属或厌氧芽孢（胞）梭菌属的细菌繁殖体，当处于不利的外界环境中，在菌体内形成厚而坚韧芽孢（胞）壁及外壳的圆形或卵圆形小体，称为芽孢（胞）。它为细菌的休眠状态，其抵抗力远远大于繁殖体，是灭菌效果的指征。芽孢（胞）可存活在自然界数年以上，一旦条件适宜，又能出芽回复为繁殖体而致病。例如炭疽、破伤风、肉毒中毒和气性坏疽等，均由芽孢（胞）菌引起。细胞壁细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为15-30nm.主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以-1，4糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。革兰氏阳性菌细胞壁厚约2080nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。此外，外膜与细胞之间还有间隙。肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成。细菌细胞壁的功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤（革兰氏阳性菌的细胞壁能耐受20kg/cm2的压力）；介导细胞间相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低细胞膜细胞膜是典型的单位膜结构，厚约810nm，外侧紧贴细胞壁，某些革兰氏阴性菌还具有细胞外膜。通常不形成内膜系统，除核糖体外，没有其它类似真核细胞的细胞器，呼吸和光合作用的电子传递链位于细胞膜上。某些行光合作用的原核生物（蓝细菌和紫细菌），质膜内褶形成结合有色素的内膜，与捕光反应有关。某些革兰氏阳性细菌质膜内褶形成小管状结构，称为中膜体（mesosome）或间体，中膜体扩大了细胞膜的表面积，提高了代谢效率，有拟线粒体（Chondroid）之称，此外还可能与DNA的复制有关 培养基培养基的概念：细菌可用人工方法大量培养，培养基是适于细菌生长繁殖需要的各种营养物质人工配制而成的基质。培养基按营养成分和用途不同，分为基础培养基、合成培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基和厌氧培养基。按培养基物理形态分为固体、半固体和液体培养基三类。根据细菌的种类和培养目的不同，可采用不同的培养基。（1）在医学中的应用用于感染性疾病的病原学诊断和药物敏感试验、细菌学的研究以及生物制品的制备。（2）在工农业生产中的应用广泛应用于制药、食品工业和污水处理等。细菌在培养基的生长状况（1）液体培养基主要用于细菌的增菌。细菌在液体培养基中生长可表现为液体变混浊，表面形成菌膜，管底沉淀物。（2）半固体培养基含有0.3%0.5%低浓度的琼脂，可用于观察细菌的动力。有鞭毛的细菌可克服低浓度琼脂的阻挡，扩散至穿刺线以外，穿刺线变混浊；无鞭毛的细菌只能在穿刺线上生长，穿刺线清晰。（3）固体培养基含2%3%的琼脂，平板固体培养基用于细菌的分离，试管固体培养基用于菌种的保存。菌落是单个细菌在固体培养基上生长繁殖后形成肉眼可见的细菌集团，是纯种细菌。细菌的菌落分为3型：光滑型菌落、粗糙型菌落和粘液型菌落。