微生物检测2.pptx
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1、第二节第二节 沙门菌检查法沙门菌检查法n美美国国细细菌菌学学家家SalmonSalmon与与SmithSmith于于18851885年年分分离离出出猪猪霍霍乱乱沙沙门门菌菌。19901990年年为为纪纪念念SalmonSalmon,定定名名这这类类细细菌菌为为沙沙门菌属。门菌属。n沙沙门门菌菌是是肠肠杆杆菌菌科科的的重重要要致致病病菌菌。包包括括伤伤寒寒、副副伤伤寒寒甲甲、乙乙、丙丙型型,肠肠炎炎,鼠鼠伤伤寒寒等等沙沙门门菌菌,现现今今已已发现发现2 2324324个血清型。个血清型。n在在世世界界各各地地的的食食物物中中毒毒中中,沙沙门门菌菌食食物物中中毒毒常常占占首首位位或或第第二二位位。
2、规规定定在在药药品品和和食食品品中中不不得得检检出出沙沙门门菌菌。美美国国每每年年报报道道病病例例45 45 000000个个左左右右,实实际际数数量量可可能能多多达达200-300200-300万。伤寒每年万。伤寒每年400-500400-500例。例。一、生物学特性一、生物学特性1 1.形态形态 两端钝圆的革兰氏阴性杆菌,两端钝圆的革兰氏阴性杆菌,(0.4-0.90.4-0.9)m m (1-3)(1-3)m m,无无芽孢,周生鞭毛,一般无荚膜,芽孢,周生鞭毛,一般无荚膜,少数有包膜。少数有包膜。光滑型的细菌大小均匀,粗光滑型的细菌大小均匀,粗糙型则大小不一,长短不一。糙型则大小不一,长短
3、不一。2 2.培养特性培养特性n在营养琼脂平板上在营养琼脂平板上18-2418-24h h培养形成无色半透明,表培养形成无色半透明,表面面光滑、湿润、隆起光滑、湿润、隆起的菌落,直径的菌落,直径2-32-3mmmm。有些菌株有些菌株在营养琼脂平板上生长不良,形成在营养琼脂平板上生长不良,形成 “侏儒侏儒”菌落,菌落,加葡萄糖或甘油,生长良好,但易使菌株粗糙加葡萄糖或甘油,生长良好,但易使菌株粗糙,呈呈干燥、无光泽、边缘不整齐干燥、无光泽、边缘不整齐。n光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀;粗糙型则产生光滑型菌在肉汤中无菌膜、无沉淀;粗糙型则产生沉淀,上层液透明。沉淀,上层液透明。n生长温度在生长温度
4、在10-4210-42,最适,最适3838;pH4.5-9pH4.5-9,最适最适pHpH6.8-7.86.8-7.8;需氧或兼性厌氧。;需氧或兼性厌氧。3 3.生化特性生化特性n靛基质靛基质-,甲基红,甲基红+,v-p-v-p-,柠檬酸盐反柠檬酸盐反应应d d,产硫化氢,尿素酶反应产硫化氢,尿素酶反应-,还原硝,还原硝酸盐,酸盐,-葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶d d,不能发酵不能发酵乳糖,可以被噬菌体裂解。乳糖,可以被噬菌体裂解。4 4.抗原结构抗原结构(1 1)抗原构造)抗原构造n菌菌体体抗抗原原(o o):不不被被乙乙醇醇、0.1%0.1%石石炭炭酸酸所所破破坏坏。与与特特异异性性抗抗血
5、血清清呈呈颗颗粒粒状状凝凝集集,形形成成慢慢,不不易易摇摇散散。现现已已知知有有5050多多种种,多多数数沙沙门门菌菌含含有有两两种种以以上上的的O O抗抗原原,有有的的O O抗抗原原是是一一种种菌菌独独有有的的,有有的的是是几几种种菌菌共共有有的的,凡凡含含有有共共同同特特异异性性抗抗原原成成分分的的血血清清型型归归为为一一个个群群,可可将将沙沙门门菌菌化化分分为为4242群群,按按A-ZA-Z排排列列,Z Z以以后后的的顺顺序序以以O O5151-O-O6767表表示示。引起人类沙门菌病的引起人类沙门菌病的95%95%以上都在以上都在A-F 6A-F 6个群内。个群内。n表表面面抗抗原原(
6、K K抗抗原原):沙沙门门菌菌中中有有三三种种K K抗抗原原,即即ViVi抗原、抗原、M M抗原和抗原和5 5抗原。抗原。q可可阻阻止止O O抗抗原原被被抗抗O O血血清清所所凝凝集集,具具有有O O不不凝凝集集性。常用于菌型鉴定。性。常用于菌型鉴定。qM M抗原:粘液抗原,在菌型鉴定上无特殊意义。抗原:粘液抗原,在菌型鉴定上无特殊意义。q5 5抗原:抗原:n鞭鞭毛毛抗抗原原(H H抗抗原原):经经乙乙醇醇或或酸酸处处理理后后失失去去与与特特异异性性抗抗体体的的结结合合力力。制制备备时时,应应用用具具有有丰丰满满鞭鞭毛毛的的菌菌种种18-2418-24h h的的培培养养物物,加加甲甲醛醛固固定
7、定或或6060以以下下加加热热后后即即成成H H抗抗原原。H H抗抗原原与与抗抗H H血血清清562562h h后后,可可出出现疏松易于摇散的絮状凝集。现疏松易于摇散的絮状凝集。沙沙门门菌菌的的H H抗抗原原有有两两相相,特特异异性性高高的的称称为为第第1 1相相(特特异异相相)抗抗原原;特特异异性性低低的的称称为为第第2 2相相(非非特特异异相相)抗抗原原;多多数数沙沙门门菌菌同同一一菌菌株株,常常可可分分离离出出两两种种H H抗抗原原的的菌菌落落,菌菌落落的的外外观观性性状状完完全全一一样样,但但与与相相应应抗抗体体作作凝凝集集反反应应时时则则明明显显不不同同。具具有有两两相相抗抗原原的的
8、称称为为双双相相菌菌,仅仅有有一一相相抗抗原原的则称为单相菌。的则称为单相菌。(2 2)抗原变异)抗原变异Smooth-Transient-RoughSmooth-Transient-Rough变变异异:为为避避免免R R型型的的出出现现,保存培养基内不应含有糖类,不要多次移种传代。保存培养基内不应含有糖类,不要多次移种传代。V-WV-W(Vi-OVi-O)变变异异:具具有有ViVi抗抗原原的的菌菌株株称称为为V V型型菌菌,失失去去ViVi抗抗原原的的菌菌株株称称为为W W型型菌菌。W W型型菌菌只只能能同同其其相相应应的的O O型血清发生凝集,而不与型血清发生凝集,而不与ViVi血清凝集。
9、血清凝集。HO-OHO-O变异:有鞭毛抗原的变异:有鞭毛抗原的HOHO型菌变为无鞭毛的型菌变为无鞭毛的O O型菌。型菌。位位相相变变异异:有有双双相相鞭鞭毛毛抗抗原原的的沙沙门门菌菌两两个个相相可可以以互互变变。通通常常在在一一个个培培养养物物内内二二相相并并存存,在在平平板板上上各各占占半半数数,但但挑挑取取单单菌菌落落,经经多多次次移移接接后后,又又出出现现两两相相各各半半现现象象,这这种种由由一一相相变变为为另另一一相相的的变变异异,称称为为位位相变异,单相菌不产生位相变异。相变异,单相菌不产生位相变异。5、发病机理和症状发病机理和症状n菌量大菌量大n活菌和菌体内毒素协同作用活菌和菌体内
10、毒素协同作用n小肠和结肠里繁殖,侵入粘膜小肠和结肠里繁殖,侵入粘膜,由淋巴,由淋巴系统进入血液系统进入血液n潜伏期潜伏期8-48hn急性期,每克粪便中沙门菌多至急性期,每克粪便中沙门菌多至10亿个亿个食物中毒的特征性症状食物中毒的特征性症状n腹泻腹泻n恶心恶心n腹痛腹痛n低烧低烧和寒颤寒颤n有时呕吐呕吐、头痛头痛、倦怠倦怠伤寒的典型症状伤寒的典型症状n持续发发热热39-40n昏睡昏睡症n剧烈腹痛腹痛(腹部痉挛痉挛)n头痛头痛n食欲不振n出现扁平的玫瑰红色点状红疹红疹(一)(一)检验程序检验程序供供试试品品供供试试液液预预增增菌菌增增菌菌DHLS.SEMBEMBMaCCMaCCTSI(三三糖糖铁
11、铁琼琼脂脂)氰化钾氰化钾赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验尿素酶试验尿素酶试验吲哚试验吲哚试验血清学试验血清学试验半固体营养琼脂半固体营养琼脂革兰染色、镜检革兰染色、镜检报报告告二、沙门菌常规检查法二、沙门菌常规检查法1.1.预增菌预增菌:u将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养,将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养,使受损伤的细菌得以修复,然后再转接至增菌使受损伤的细菌得以修复,然后再转接至增菌培养基中。培养基中。u一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用乳糖肉汤作预增菌液。以乳糖肉汤作预增菌液。以1 1:1010的比例接种,的比例接种,18-2418
12、-24h,35-37h,35-37。预增菌培养基的选择预增菌培养基的选择培养基培养基商品商品缓冲蛋白胨水(缓冲蛋白胨水(BPW)使用于所有商品使用于所有商品BPW+酪蛋白酪蛋白巧克力巧克力乳糖肉汤乳糖肉汤蛋和蛋制品,火腿,蛋和蛋制品,火腿,pH6的着的着色食品色食品乳糖肉汤乳糖肉汤+表面活性剂表面活性剂7或曲拉通或曲拉通X-100椰肉,肉,干燥或加工过的动物椰肉,肉,干燥或加工过的动物食品食品乳糖肉汤乳糖肉汤+0.5%凝胶酶凝胶酶凝胶凝胶脱脂乳脱脂乳+亮绿亮绿巧克力,糖,糖衣巧克力,糖,糖衣胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤香料、香草、干酵母香料、香草、干酵母胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤+0
13、.5%硫酸钾硫酸钾洋葱和蒜粉等洋葱和蒜粉等水水+亮绿亮绿奶粉奶粉2.选择性增菌选择性增菌n取取1 1mLmL预增菌液转种至增菌培养基预增菌液转种至增菌培养基1010mLmL。37372424h h,培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养基,我国与英国相同采用后者。美、日基,我国与英国相同采用后者。美、日采用二者联用有助于提高沙门菌的检出采用二者联用有助于提高沙门菌的检出率。率。转接到选择性转接到选择性培养基培养基免免疫疫 磁磁性性分分离离技技术术(Immunomagnetic separation,IMS)3.分
14、离培养分离培养选择性培养基:选择性培养基:nDHLDHL:无色半透明,产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明,产硫化氢的菌落中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色nHEHE:蓝绿或蓝色,产硫化氢的菌落中心黑色蓝绿或蓝色,产硫化氢的菌落中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株黄色、中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株黄色、中心黑色nSSSS:无色半透明,产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明,产硫化氢的菌落中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑,乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色n分分离离沙沙门门菌菌应应以以出出现现单单个个菌菌落落为为准准,否否则则应应重重新分离。新分离。n由由
15、于于平平板板用用前前未未烘烘干干,或或因因分分离离不不良良菌菌落落连连片片均须重新分离。均须重新分离。n致致病病菌菌菌菌落落一一般般在在经经36243624h h培培养养后后,再再放放置置室室温温2-32-3天天后后不不发发生生变变化化,而而非非致致病病菌菌则则继继续续增生、增厚,并带黄灰色,并产生臭味。增生、增厚,并带黄灰色,并产生臭味。n对可疑菌落可放置室温观察几天,再决定取舍对可疑菌落可放置室温观察几天,再决定取舍(1)(1)初步鉴别试验:初步鉴别试验:三糖铁琼脂三糖铁琼脂|乳糖乳糖:蔗糖蔗糖:葡萄糖葡萄糖=10:10:1|以酚红作指示剂以酚红作指示剂|当当待待检检菌菌发发酵酵乳乳糖糖或
16、或蔗蔗糖糖时时,产产酸酸量量多多,使使整整个个培培养养基基均均呈呈黄黄色色;如如仅仅发发酵酵葡葡萄萄糖糖,则则产产酸酸少少,斜斜面面由由于于细细菌菌生生长长分分解解蛋蛋白白胨胨而而释释放氨,酚红显碱性红色、而底层黄色放氨,酚红显碱性红色、而底层黄色|细细菌菌对对培培养养基基中中硫硫代代硫硫酸酸钠钠或或硫硫酸酸钠钠、亚亚硫硫酸酸钠钠的的还还原原作作用用,生生成成硫硫化化氢氢。硫硫化化氢氢遇遇硫硫酸酸亚亚铁铁或或柠柠檬檬酸酸铁铁铵铵产产生生不不溶溶性性黑黑色色硫硫化化亚铁。亚铁。4.生化试验生化试验斜面红色、底层黄色,出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色,出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄
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