微生物教程yyd非细胞微生物.pptx

第四章非细胞微生物的形态结构l l前言l l第一节 病毒（指真病毒）l l第二节 亚病毒非细胞生物就是指的病毒（非细胞生物就是指的病毒（virusvirus）,从历史上从历史上看人们早已和病毒有过接触，在公元前看人们早已和病毒有过接触，在公元前2 23 3世纪世纪我国及印度既有天花记载，而病毒的发现是在我国及印度既有天花记载，而病毒的发现是在18901890，俄国植物病理学家，俄国植物病理学家D.Ivanovekg(D.Ivanovekg(伊万诺夫伊万诺夫斯基斯基)的功绩，当时发现了烟草花叶病的病原，可的功绩，当时发现了烟草花叶病的病原，可通过细菌滤器，认为是通过细菌滤器，认为是“细菌的毒素细菌的毒素”或极小的或极小的“细菌细菌”。l l18981898年由荷兰学者年由荷兰学者M.W.BeijerinekM.W.Beijerinek（贝杰林克）贝杰林克）首次提出这种病毒是一种首次提出这种病毒是一种“传染性的活性液传染性的活性液”或或称称“病毒病毒”，从此揭开了现代病毒学的历史。此，从此揭开了现代病毒学的历史。此外各种动、植物病毒相继发现，电镜的应用促进外各种动、植物病毒相继发现，电镜的应用促进了病毒学的发展，了病毒学的发展，19711971后人们陆续发现了各种亚后人们陆续发现了各种亚病毒病毒类病毒（类病毒（1971 1971 DienerDiener）朊病毒（朊病毒（1982 1982 PrusinerPrusiner）和拟病毒（和拟病毒（Gibbs,1983Gibbs,1983）人们对病毒人们对病毒本质的认识是一个循序渐进的过程本质的认识是一个循序渐进的过程非细胞生物非细胞生物 真病毒：至少含有核酸和蛋白质两种组分真病毒：至少含有核酸和蛋白质两种组分亚病毒亚病毒类病毒：只含具有独立侵类病毒：只含具有独立侵染性的染性的RNARNA组分组分拟病毒：只含不具有独立拟病毒：只含不具有独立侵染性的侵染性的RNARNA组分组分朊病毒：只含单一蛋白质朊病毒：只含单一蛋白质组分组分这里把非细胞生物分成病毒（真病毒）和亚病毒讨论l l从所给病毒的定义可以总结出病毒的特点是从所给病毒的定义可以总结出病毒的特点是非细胞大分子结构亦由此衍化出无产能代谢系非细胞大分子结构亦由此衍化出无产能代谢系统，无核糖体，无离体生长，无二等分裂繁殖，统，无核糖体，无离体生长，无二等分裂繁殖，对一般抗生素不敏感等。对一般抗生素不敏感等。专性活细胞内寄生专性活细胞内寄生的生物态和细胞外无生物态的相互交替的生物态和细胞外无生物态的相互交替只含只含一种核酸或一种核酸或DNADNA或或RNARNA。l l真真病病毒毒的的定定义义：由由于于亚亚病病毒毒（特特别别是是朊朊病病毒毒的的存存在在）难难以以给给病病毒毒下下确确切切的的定定义义，这这里里给给“真真”病病毒毒的的定定义义为为：病病毒毒是是一一类类超超显显微微的的非非细细胞胞生生物物，每每种种病病毒毒只只含含一一种种核核酸酸；它它们们只只能能在在活活细细胞胞内内营营专专性性寄寄生生，靠靠宿宿主主细细胞胞代代谢谢系系统统的的协协助助来来复复制制核核酸酸、合合成成蛋蛋白白质质等等组组分分，然然后后再再装装配配而而得得以以增增殖殖；在在离离体体状状态态它它们们呈呈无无生生命命的的大大分子状态长期存在，并保持侵染活性。分子状态长期存在，并保持侵染活性。返回目录第一节 病毒（指真病毒）l l病毒的特点：病毒的特点：l l形形体体极极微微小小必必须须用用电电镜镜观观察察，一一般般可可通通过过细细菌菌滤器滤器l l没有细胞构造故称分子生物没有细胞构造故称分子生物l l主要成分只有核酸和蛋白质主要成分只有核酸和蛋白质l l每种病毒只有一种核酸或每种病毒只有一种核酸或DNADNA或或RNARNAl l既无产能系统也无蛋白质合成系统既无产能系统也无蛋白质合成系统l l在在宿宿主主细细胞胞协协助助下下通通过过核核酸酸复复制制和和核核蛋蛋白白装装配配进行增殖无个体生长和二分裂繁殖进行增殖无个体生长和二分裂繁殖l l活细胞内专性寄生活细胞内专性寄生l l离体状态为无生命的大分子，并可形成结晶离体状态为无生命的大分子，并可形成结晶l l对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。l l 凡有生物处（因是活细胞内寄生物）都应凡有生物处（因是活细胞内寄生物）都应有其相应的病毒，所以随着研究的进展，病毒有其相应的病毒，所以随着研究的进展，病毒的数量是一个上升的变量。的数量是一个上升的变量。一、病毒的形态构造和化学组分（一）、病毒的大小l l 绝大多数病毒能通过细菌滤器，须用电镜观绝大多数病毒能通过细菌滤器，须用电镜观察测其形态和大小，测量时以纳米（察测其形态和大小，测量时以纳米（nm 10nm 10-9-9m m）为为单位，多数病毒粒子的单位，多数病毒粒子的D D（直径直径)在在100nm100nm左右，最左右，最大的牛痘苗病毒的直径超过大的牛痘苗病毒的直径超过250250nmnm，染色在光镜下染色在光镜下可见。最小的病毒菜豆畸矮病毒只有可见。最小的病毒菜豆畸矮病毒只有9 91111nmnm，比比血清白蛋白分子还小（详见书血清白蛋白分子还小（详见书6 64 4页）。页）。（二）形态l l1.1.典典型型病病毒毒粒粒子子的的构构造造：病病毒毒也也称称病病毒毒粒粒子子（virionvirion即即病病毒毒体体），也也叫叫病病毒毒颗颗粒粒（virusvirus）是是指指成成熟熟结结构构完完整整的的单单个个病病毒毒，主主要要成成分分是是核核酸酸和和蛋蛋白白质质。核核酸酸位位于于病病毒毒粒粒子子的的中中心心，构构成成核核子子（corecore）或或基基因因组组（genomegenome）；蛋蛋白白质质包包围围在在核核心心周周围围，构构成成病病毒毒粒粒子子的的衣衣壳壳（capsidcapsid）。衣衣壳壳是是病病毒毒粒粒子子的的主主要要支支架架结结构构和和AgAg成成分分，对对核核酸酸有有保护作用。保护作用。l l衣衣壳壳由由许许多多电电镜镜下下可可见见的的形形态态单单位位-衣衣壳壳粒粒（capsomerecapsomere或或capsomercapsomer）所所构构成成，核核心心与与衣衣壳壳合合在在一一起起称称核核衣衣壳壳，它它是是（真真）病病毒毒必必须须具具备备的的基基本本结结构构。有有些些复复杂杂的的病病毒毒核核衣衣壳壳外外还还围围一一层层由由脂脂类类和和蛋蛋白白组组成成的的包包膜膜。有有时时包包膜膜上上长长有有刺刺突突（spikespike）等等附附属属物物，其其包包膜膜来来自自于于宿宿主主细细胞胞膜膜并并被被病病毒毒改改造造成成具具有有独独特特抗抗原原特特性性的的膜状结构，可被乙醚等有机溶剂所破坏。膜状结构，可被乙醚等有机溶剂所破坏。病毒体结构模式图病毒体结构模式图壳粒壳粒衣壳衣壳核心（核样物）核心（核样物）核衣壳核衣壳包膜包膜包膜病毒包膜病毒包膜子粒包膜子粒2.病毒粒子的对称体制l l 病病毒毒由由相相同同的的蛋蛋白白质质亚亚基基衣衣壳壳粒粒装装配配而而成成的的病病毒毒粒粒子子，通通常常只只有有形形成成螺螺旋旋对对称称和和二二十十面面体体对对称称（等等轴轴对对称称）的的两两种种体体制制，前前者者能能使使核核酸酸与与蛋蛋白白质质亚亚基基间间的的接接触触更更为为紧紧密密，后后者者则则特特别别有有利利于于核核酸酸分分子子的的高高度度卷卷曲曲的的形形式式包包裹裹在在小小体体积积的的衣衣壳壳中中，也也有有些些以以螺螺旋旋对对称称和和二二十十面面体体对对称称的的相相结结合称之为复合对称。合称之为复合对称。螺旋对称螺旋对称无包膜无包膜 杆状：烟草花叶病毒（杆状：烟草花叶病毒（TMVTMV）等等对称体制对称体制丝状：大肠杆菌的丝状：大肠杆菌的f1,fd,M13f1,fd,M13噬噬菌体等菌体等有包膜卷曲状：正粘病毒（流感病毒）有包膜卷曲状：正粘病毒（流感病毒）等等弹状：狂犬病毒，水泡性口膜弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等炎病毒等二十面体对称二十面体对称 无包膜无包膜 小型：脊髓灰质病毒，噬菌小型：脊髓灰质病毒，噬菌 体等体等大型：腺病毒等大型：腺病毒等有包膜：疱疹病毒等有包膜：疱疹病毒等复合对称复合对称无包膜：大肠杆菌的偶数噬菌体无包膜：大肠杆菌的偶数噬菌体（蝌蚪状）等（蝌蚪状）等有包膜：痘病毒（砖块状）有包膜：痘病毒（砖块状）3.病毒的群体形态（1）包涵体l l 在某些感染病毒的宿主细胞内出现光学显微镜可见的大小形态数量不等的小体叫包涵体。多数位于胞质内噬酸性；少数位于胞核噬碱性，或质、核中均有之。依包涵体的特点可将它们分成四种类型：l l病毒的聚集体病毒的聚集体l l大多数由动物病毒引起的包涵体是病毒的合大多数由动物病毒引起的包涵体是病毒的合成部位。成部位。l l是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质构成是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质构成的的l l非病毒性包涵体：某些化学因子甚至由于细非病毒性包涵体：某些化学因子甚至由于细菌感染也可形成的不属于病毒的群体形态。菌感染也可形成的不属于病毒的群体形态。l l包涵体在实际的应用中有两方面：一是诊断鉴包涵体在实际的应用中有两方面：一是诊断鉴定病毒病；二是用于生物防治如昆虫的核型多定病毒病；二是用于生物防治如昆虫的核型多角体病毒和质型多角体病毒。角体病毒和质型多角体病毒。（2）噬菌斑l l 将将少少量量噬噬菌菌体体与与大大量量敏敏感感菌菌混混合合然然后后加加入入约约4545的的琼琼脂脂中中，制制平平板板经经培培养养后后平平板板表表面面长长满满菌菌苔苔的的背背景景上上出出现现肉肉眼眼可可见见的的透透明明不不长长菌菌的的圆圆斑斑，这这即即为为噬噬菌菌斑斑。一一般般是是由由一一个个噬噬菌菌体体侵侵染染一一个个细细菌菌后后增增殖殖后后释释放放出出大大量量子子群群代代噬噬菌菌体体，再再感感染染周周围围细细菌菌细细胞胞，又又增增殖殖裂裂解解，多多次次反反复复的的结结果果，噬噬菌菌斑斑只只是是聚聚“负负菌菌落落”。噬噬菌菌斑斑的的形形成成可可用用于于检检出、分离（纯化）和计数噬菌体。出、分离（纯化）和计数噬菌体。（3）空斑和病斑l l 在噬菌斑的启发下发明了单层动物细胞上的空斑计数法，在覆盖一薄层琼脂的单层细胞上，如果一细胞感染有病毒，增殖的病毒只能再扩散到邻近细胞，最终成为类似噬菌斑的空斑，如用中性红等活性染料染色，既可区分死、活细胞，而且使空斑更清晰。若单层细胞受致肿瘤病毒感染，细胞会剧增，这种类似于菌落的病灶就只能称为病斑了。（4）枯斑l l 是植物叶片上的植物病毒群体，即病毒使植物细胞产生的坏死灶。（三）三类典型形态的病毒 1.螺旋对称的代表烟草花叶病毒（TMV）l l 为杆状长为杆状长300300nmnm，宽宽1515 nmnm，中空（内径中空（内径4 4nmnm）含含95%95%的蛋白质和的蛋白质和5%5%单链单链RNARNA（ssRNAssRNA），），有有21302130个皮鞋状的衣壳粒，每个衣壳粒由个皮鞋状的衣壳粒，每个衣壳粒由158158个氨基个氨基酸组成，分子量酸组成，分子量1750017500。衣壳粒以逆时针方向螺旋。衣壳粒以逆时针方向螺旋排列共排列共130130圈（每圈长圈（每圈长2.32.3nmnm，有有16.3316.33个壳粒），个壳粒），ssRNAssRNA含含63906390个核苷酸，分子量个核苷酸，分子量2102106 6，距中心轴，距中心轴4 4nmnm以相等的螺距盘绕于蛋白质的外壳内，每三个以相等的螺距盘绕于蛋白质的外壳内，每三个核苷酸和一个衣壳粒结合，每周核苷酸和一个衣壳粒结合，每周4949个核苷酸。个核苷酸。2.二十面体对称的代表腺病毒l l为动物病毒其外形呈典型的二十面体，呈球状，为动物病毒其外形呈典型的二十面体，呈球状，无包膜，直径无包膜，直径70708080nmnm有有1212个角，个角，2020个面，个面，3030条边，衣壳由条边，衣壳由252252个壳粒组成，内有称五邻体的壳个壳粒组成，内有称五邻体的壳粒粒1212个分布个分布1212个顶角；还有称六邻体的衣壳粒个顶角；还有称六邻体的衣壳粒240240个分布在个分布在2020个面上，每个五邻体上突出一根个面上，每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维称刺突。其核心是线状末端带有顶球的蛋白纤维称刺突。其核心是线状双股双股DNADNA（dsDNAdsDNA）。）。所有腺病毒（不分宿主和所有腺病毒（不分宿主和血清型）基因组均为血清型）基因组均为3650036500个核酸对。个核酸对。3复合对称的代表T偶数噬菌体l lEcoliEcoli的的T T偶数噬菌体共有三种即偶数噬菌体共有三种即T2T2、T4T4和和T6T6，分布较分布较广的广的T4T4了解最清了解最清.T4(.T4(图图)由头部、颈部和尾部三部分组成，由头部、颈部和尾部三部分组成，头部为二十面体对称，尾部为螺旋对称，故称复合对称。头部为二十面体对称，尾部为螺旋对称，故称复合对称。头部的二十面体共有头部的二十面体共有212212个衣壳粒，核心为线状个衣壳粒，核心为线状dsDNAdsDNA。头头与尾间有颈环和颈须结构。颈环均为六角形盘状，与尾间有颈环和颈须结构。颈环均为六角形盘状，6 6根颈根颈须自颈环发出，其功能是裹住吸附前的尾丝，尾部由尾鞘、须自颈环发出，其功能是裹住吸附前的尾丝，尾部由尾鞘、尾管、基板、刺突和尾丝五部分构成。尾鞘是由壳粒缠绕尾管、基板、刺突和尾丝五部分构成。尾鞘是由壳粒缠绕2424环的螺旋。尾管中央有孔道，是头部核酸注入宿主细胞环的螺旋。尾管中央有孔道，是头部核酸注入宿主细胞的必经之道。尾管也由的必经之道。尾管也由2424环螺旋组成，恰好与尾鞘对应，环螺旋组成，恰好与尾鞘对应，尾部的基板与颈环一样为六角、盘状、中空，尾丝较长折尾部的基板与颈环一样为六角、盘状、中空，尾丝较长折为等长的两段，它能吸附在宿主细胞的专一性受体上。为等长的两段，它能吸附在宿主细胞的专一性受体上。（四）病毒的核酸l l 病毒的核酸种类很多，是分类的分子基础，病毒的核酸类型可以从以下几点来区分：是DNA还是RNA是单链结构（ss single strand）还是双链（ds double strand）是线状还是环状是闭环还是缺口环基因组是单组分、双组分、三组分还是多组分。此外还可对核酸进行更细致的分析比较，见表。l l 总的来说动物病毒以线状dsDNA和ssRNA为多，植物病毒以ssRNA为主，噬菌体以线状dsDNA居多，至今发现的真菌病毒均为dsRNA，藻类病毒则都是dsDNA。二 各类（噬菌体）病毒及其繁殖方式l l（一）原核生物的病毒（一）原核生物的病毒噬菌体噬菌体l l1 1.一一般般介介绍绍 噬噬菌菌体体（bacteriophage,phagebacteriophage,phage）,至至今今绝绝大大多多数数微微生生物物都都发发现现相相应应的的噬噬菌菌体体，据据Bradley(1967)Bradley(1967)归纳，噬菌体共有六类形态归纳，噬菌体共有六类形态.2噬菌体的繁殖l l一般可分为吸附一般可分为吸附侵入侵入增殖（复制与生物合增殖（复制与生物合成）成）成熟（装配）成熟（装配）裂解（释放）五个阶段。裂解（释放）五个阶段。凡在短期内能连续完成这五个阶段而实现繁殖的凡在短期内能连续完成这五个阶段而实现繁殖的噬菌体称为烈性噬菌体。反之称为温和噬菌体。噬菌体称为烈性噬菌体。反之称为温和噬菌体。裂性噬菌体所经历的繁殖过程称为裂解性生活周裂性噬菌体所经历的繁殖过程称为裂解性生活周期或增殖性生活周期，现以期或增殖性生活周期，现以T T偶数噬菌体为代表介偶数噬菌体为代表介绍这五个阶段绍这五个阶段l l （1）吸附（adsorption）当噬菌体与宿主细胞在溶液中相遇，若尾丝尖端与宿主表面的特异受体接触，即可触发颈须把弯曲的尾丝散开，附着在受体上，使尾刺、尾板固着在细胞表面，每个细菌表面约有300个吸附位点，不同的噬菌体吸附位点不同。l l影响吸附的因素：影响吸附的因素：l l噬噬菌菌体体量量，宿宿主主细细胞胞表表面面特特异异受受体体的的数数量量决决定定了了吸吸附附噬噬菌菌体体的的数数量量，每每一一敏敏感感细细胞胞所所能能吸吸附附 相相 应应 噬噬 菌菌 体体 的的 数数 量量 称称 感感 染染 复复 数数（m.o.i,multiplicity m.o.i,multiplicity of of infectioninfection）,感感染染复复数数一一般般很很大大，可可达达250250360360。当当大大量量噬噬菌菌体体同同时时吸吸附附一一个个敏敏感感细细胞胞，由由于于噬噬菌菌体体尾尾管管口口都都带带有有少少量量的的溶溶菌菌酶酶可可使使宿宿主主细细胞胞表表面面顿顿时时出出现现“千千疮疮百百孔孔”而而裂裂解解，这这种种由由超超m.o.im.o.i的的外外源源噬噬菌菌体体吸吸附附引引起起的的不不能能产产生生子子代代噬噬菌菌体体的的裂裂解解叫自外裂解（叫自外裂解（lysisfrom withoutlysisfrom without）l l阳离子：Ca2+,Mg2+和Ba2+促进吸附；Al3+、Fe3+和Cr3+不利于吸附。l l辅助因子，如色氨酸，生物素可促进吸附l lPH：中性有利于吸附，在小于5和大于10时则不利l l温度：最适生长温度有利于吸附。（2）侵入（penetration）l l吸附后，尾板从尾丝中获得一个构型刺激，尾吸附后，尾板从尾丝中获得一个构型刺激，尾鞘的亚基发生复杂移位，缩成原长的一半将尾管鞘的亚基发生复杂移位，缩成原长的一半将尾管推出并插入细胞壁及膜中，接着头部核酸通过尾推出并插入细胞壁及膜中，接着头部核酸通过尾管注入宿主细胞将蛋白衣壳留在细胞壁外，这一管注入宿主细胞将蛋白衣壳留在细胞壁外，这一时间很短，合适温度时间很短，合适温度T4T4只需只需1515s s。若有两种以上若有两种以上噬菌体同时侵入一个细胞，最后只有一种得以增噬菌体同时侵入一个细胞，最后只有一种得以增殖。且不影响其子代的数量。这称相互排斥；反殖。且不影响其子代的数量。这称相互排斥；反之被排斥的噬菌体能使增殖的噬菌体的释放量减之被排斥的噬菌体能使增殖的噬菌体的释放量减少，则称为抑制作用。少，则称为抑制作用。（3）增殖（replication）l l增殖包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。增殖包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。首先噬菌体以其核酸中的遗传信息对宿主细胞发首先噬菌体以其核酸中的遗传信息对宿主细胞发出指令并提供出指令并提供“蓝图蓝图”，使宿主的代谢途径转向，使宿主的代谢途径转向合成噬菌体的合成噬菌体的“组分组分”和和“部件部件”，其，其“原料原料”可通过宿主原有核酸等的降解，代谢库内的储存可通过宿主原有核酸等的降解，代谢库内的储存物或从环境中摄取，大批的物或从环境中摄取，大批的“部件部件”合成后，则合成后，则在细胞在细胞“工厂工厂”里突击装配，于是产生了一大群里突击装配，于是产生了一大群大小相等，成熟的子代噬菌体粒子。大小相等，成熟的子代噬菌体粒子。l l烈性噬菌体的增殖以其核酸类型分三类按早期、次早期、晚期基因的顺序转录、转译和复制的dsDNA噬菌体方式。按滚环模型复制ssDNA的二十面体噬菌体（x174）和丝状噬菌体（f1）的方式l l按“花朵”复制A蛋白（成熟蛋白），衣壳蛋白和复制酶蛋白的（复制RNA用）的方式，以第一种方式讲解。l l 当噬菌体的dsDNA侵入细胞，先用宿主原有的RNA聚合酶转录噬菌体早期的mRNAmRNA再转译成噬菌体的早期蛋白这种现象又称早期转录，其中早期蛋白种类很多，最关键的是一种只能转录噬菌体次早期mRNA聚合酶。而T4等的早期蛋白则称更改蛋白，特点是无RNA聚合酶的能力，但能与原细胞中的RNA聚合酶结合，改变后者，使之只能转录噬菌体的次早期基因，至此噬菌体已能大量合成自己所需的mRNA了。l l利用早期蛋白中新合成的或更改后的利用早期蛋白中新合成的或更改后的RNARNA聚合酶来转录聚合酶来转录噬菌体的次早期基因，借以产生次早期噬菌体的次早期基因，借以产生次早期mRNAmRNA的过程称的过程称次早期转录次早期转录其其mRNAmRNA称次早期称次早期mRNAmRNA进一步的转译称次进一步的转译称次早期转译早期转译 结果是产生多种次早期蛋白，有分解寄主结果是产生多种次早期蛋白，有分解寄主细胞细胞DNADNA的的DNADNA酶，复制噬菌体酶，复制噬菌体DNADNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，HMCHMC（5-5-羟基胞嘧啶）合成酶，以及供晚期基因转录用羟基胞嘧啶）合成酶，以及供晚期基因转录用的晚期的晚期mRNAmRNA聚合酶。聚合酶。l l晚期转录是指在新的噬菌体晚期转录是指在新的噬菌体DNADNA复制完成后对晚期基因复制完成后对晚期基因进行转录作用进行转录作用结果产生晚期结果产生晚期mRNAmRNA，再经晚期转译再经晚期转译就产生一大批可用于子代噬菌体装酶用的部分就产生一大批可用于子代噬菌体装酶用的部分-晚期蛋晚期蛋白，即头部蛋白，尾部蛋白，各种装配蛋白（约白，即头部蛋白，尾部蛋白，各种装配蛋白（约3030种）种）和溶菌酶等，至此核和溶菌酶等，至此核 酸复制和各种蛋白质的生物合成酸复制和各种蛋白质的生物合成就完工了。就完工了。l l各种核酸型病毒的复制，关键是新代V的生物学特性遗传给子代V，即在不同类型的核酸中将遗传信息转移到V的mRNA中，Baltimore1971将其分六类。l lDNA病毒双链DNA的复制：复制、转录、转译均按“中心法则”。DNA可作复制的模板，以半保留复制方式复制出子代 DNA，又可转译成成熟V所需的衣壳蛋白。l l+DNA病毒ssDNA的复制，所有ssDNA病毒的核酸均为+DNA，先由+DNA合成DNA，在以-DNA为模板合成mRNAl lRNARNA双双链链RNARNA病病毒毒的的复复制制 以以半半保保留留方方式式复复制制利利用用其其中中“-”链链产产生生“+”RNARNA即即mRNAmRNA，它它可可转转译译出出蛋蛋白白又又可为模板复制出子代可为模板复制出子代dsRNAdsRNA。l l+RNA+RNA侵侵染染性性单单链链RNARNA病病毒毒的的复复制制，侵侵染染性性ssRNAssRNA指指由由病病毒毒粒粒子子中中分分离离出出来来的的RNARNA便便有有侵侵染染性性。这这种种侵侵染染性性的的RNARNA即即可可做做mRNAmRNA以以转转译译成成蛋蛋白白，又又可可做做模模板板复复制制成成“-”RNARNA，再以此链作模板来合成子代再以此链作模板来合成子代“+”RNARNA。l l-RNA-RNA非非侵侵染染性性ssRNAssRNA的的病病毒毒的的复复制制：其其RNARNA无无侵侵染染性性，也也不不能能起起信信使使作作用用，称称负负链链RNARNA（-RNA-RNA），当当病病毒毒粒粒子子有有转转录录酶酶时时-RNARNA可可用用做做转转录录“+”RNARNA（mRNAmRNA）的的模模板板，并并转转译译几几种种蛋蛋白白质质，其其中中有有一一种种RNARNA复复制制酶酶，在在该该酶酶催催化化下下合合成成与与“-”RNARNA等等长长的的“+”RNARNA再再以以此此为为模模板板合合成子代病毒的成子代病毒的“-”RNARNA。l l逆逆转转录录病病毒毒单单链链RNARNA的的复复制制 特特点点：逆逆转转录录病病毒毒ssRNAssRNA在在复复制制时时会会形形成成RNARNADNADNA杂杂交交分分子子和和双双链链DNADNA两两种种中中间间体体。RNARNADNADNA杂杂交交分分子子是是由由病病毒毒粒粒子子所所含含有有的的一一种种反反转转录录酶酶依依赖赖RNARNA的的DNADNA聚聚合合酶酶催催化化合合成成的的，所所合合成成的的DNADNA链链又又在在一一种种依依赖赖DNADNA聚聚合合酶酶作作用用下下再再合合成成dsDNAdsDNA。此此DNADNA具具有有侵侵染染性性，就就整整合合到到寄寄主主细细胞胞的的DNADNA上上，以以它它为为模模板板合合成成子子代代单单链链RNARNA，其其子子代代RNARNA和和亲亲代代RNARNA均均可可作作为为mRNAmRNA合合成成各各种种蛋蛋白白质质（既既糖糖蛋蛋白白、内内部部蛋蛋白白、逆逆转转录录酶酶和和转转化化蛋蛋白白等等)。这这种种转转化化蛋蛋白白在在适适当当的的时时候候能能将将寄寄主主细细胞胞转转化化成成各种肿瘤细胞。各种肿瘤细胞。（）成熟（装配）l l噬菌体的成熟（maturity）过程实际是已合成的各种部件的装配（assembly）过程。主要步骤：DNA分子缩合衣壳包裹形成头部尾丝和尾部的其它部件独立装配完成头部与尾部相结合最后装上尾丝，形成一个大小相等成熟的噬菌体粒子。（）裂解（释放）l l大量子代噬菌体已成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶作用，从细胞内部促进了细胞的裂解，从而实现了噬菌体的释放，E.coliT系噬菌体就是这样，另外一些纤维状的噬菌体如E.colifr、fd和M13等其衣壳蛋白合成后沉积于细胞膜，当噬菌体外出穿过膜时才与衣壳蛋白结合，这种情况不破坏细胞壁，宿主细胞仍继续存活生长。l l上述增殖性生活周期是较短的如E.coli系在适宜温度下只需分钟。每个宿主细胞裂解后产生子代噬菌体的量称裂解量（burstsize），不同的噬菌体裂解量不同，例如T2为左右（），T4约，而f2高达。.噬菌体效价的测定l l利用其在敏感菌的菌苔可以形成噬菌斑的数目即可以测定效价(数)。效价（titre,titer）在此定义为：每毫升试样中所含有侵染性噬菌体粒子数，也称噬菌斑形成单位（pfu,plaqueformingunit）或感染中心数（infectivecentre），另外，依噬菌斑的形状，大小，边缘和透明度可以进行鉴定噬菌体，或进行分离。（1）斑点实验法l l这是一种半定量的预实验方法，先将敏感的宿主菌浓悬液涂布于合适的培养基平板上，倒扣在45温箱以除表面水膜，再将不同稀释度的试样用接种环点种在平板上，保温数小时，依点种处是否有噬菌斑以初步判断试样的效价。（2）液体稀释管法l l先将不同稀释度的试样培养液加入各试管，再将各管接入对数期的宿主细胞以不长菌的最高稀释管计算效价。（3）双层平板法l l较广被用的精确效价测定方法：方法预先分别配2%和1%琼脂的底层和上层培养基。前者取78ml平皿浇层，再在后者取3ml（须融化并冷却到约45）中加入较浓的对数期敏感菌（0.2ml）和一定体积（0.1ml）的待测并稀释的试样充分混匀倒上层铺平待凝保温10小时，可进行噬菌斑计算。l l该法优点：l l有底层培养基弥补了平皿不平的缺点全部噬菌斑都处于同一平面无重叠，大小相近边缘清晰。l l上层培养基中琼脂量少使噬菌斑较大，易于计数。（4）单层平板法l l无双层平板法的底层培养基，所用培养基的浓度和加量均比双层法的上层培养基为高和多，该法虽较简便但效果较差。（5）玻片快速法l l将噬菌体及敏感宿主细胞与适量的琼脂培养基（含0.50.8%琼脂，先融化）充分混合，涂布无菌载玻片上，短期培养后在低倍显微镜或扩大镜下既可计算，如金葡球菌仅2.54小时即可，精确度较差。4.一步生长曲线（onestep growth curve）l l定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称一步生长曲线或一级生长曲线，它可反映噬菌体的三个最重要特性参数潜伏期、裂解期和裂解量。l lT4噬菌体的一步生长曲线（1）潜伏期l l指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配并释放前的一段时间，潜伏期中无一个成熟的噬菌体粒子自细胞中释放。该期分两段：l l隐晦期，指在潜伏期前期人为（用氯仿）裂解隐晦期，指在潜伏期前期人为（用氯仿）裂解细胞裂解液仍无侵染性的一段时间。细胞裂解液仍无侵染性的一段时间。l l胞内累积期也叫潜伏后期，在隐晦期后如人为胞内累积期也叫潜伏后期，在隐晦期后如人为的裂解细胞其裂解液出现侵染性的一段时间，在的裂解细胞其裂解液出现侵染性的一段时间，在电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。（2）裂解期l l为在潜伏期后，宿主细胞迅速裂解，溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。因噬菌体或病毒无生长及宿主细胞裂解的突发性，因此理论上的裂解期应是瞬间的，但实际细菌菌体中个别细胞的裂解不可能是同步的，故实际的裂解期是较长的。（3）平稳期l l指感染的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效指感染的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点之后的时期。价达到最高点之后的时期。l l一步生长曲线一步生长曲线ellisellis和和DelbriickDelbriick于于19391939年设计，年设计，其操作是：用噬菌体的稀释悬液去感染高浓度的其操作是：用噬菌体的稀释悬液去感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞至多不超过一个噬菌宿主细胞，以保证每个细胞至多不超过一个噬菌体吸附，数分钟吸附后，混合液中加入一定量的体吸附，数分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体抗血清以中和未吸附的噬菌体。然后用该噬菌体抗血清以中和未吸附的噬菌体。然后用保温的培养液来稀释此混合液，同时终止血清的保温的培养液来稀释此混合液，同时终止血清的作用，随即置该菌的适宜生长温度下培养，在一作用，随即置该菌的适宜生长温度下培养，在一定时间内，每隔数分钟从混合液中取出一份试样，定时间内，每隔数分钟从混合液中取出一份试样，并作效价测定即得此曲线。并作效价测定即得此曲线。5溶原性：两个概念（lysogeny）（1）温和噬菌体l l 噬菌体侵入细胞后其DNA只整合在宿主的染色体组上，并随之繁殖而同步复制，一般情况不增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体称temperate phage或溶原噬菌体（lysogenie phage）.裂性噬菌体的裂解性生活周期与温和噬菌体的溶原性生活周期关系温和噬菌体的特点l l核酸类型均为dsDNAl l具有整合能力，其核酸与敏感宿主细胞的核基因组整合，整合态的噬菌体称作前噬菌体（prophage）l l具有同步复制能力，复制后平均分布到二个子代细胞中代谢相传。l l因此温和噬菌体有三种存在形式：l l游离态：成熟后释放的具侵染性的游离噬菌体粒子l l整合态：即整合在宿主染色体上的前噬菌体状态l l营养态：前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主基因组进行复制、装配的状态。（2）溶原菌（lysogen或lysogenic bacteria）l l指在染色体组上整合有前噬菌体并正常生长指在染色体组上整合有前噬菌体并正常生长繁殖而不被裂解的细菌（或其它微生物），溶原繁殖而不被裂解的细菌（或其它微生物），溶原菌有以下几个显著特性：菌有以下几个显著特性：l l自自发发裂裂解解（spontoneous spontoneous lysislysis）溶溶原原菌菌在在分分裂裂时时有有1010-2-21010-5-5细细胞胞会会发发生生自自发发裂裂解解，原原因因系系少少数数整整合合状状态态的的前前噬噬菌菌体体转转变变为为营营养养状状态态的的裂裂解解性性噬噬菌体。菌体。l l诱诱导导 是是溶溶原原菌菌在在外外界界理理化化因因子子作作用用下下发发生生的的高高频频裂裂解解现现象象。紫紫外外线线、x x射射线线某某些些DNADNA合合成成抑抑制制丝丝裂霉素、氮芥等都有诱导作用。裂霉素、氮芥等都有诱导作用。l l免免疫疫性性（immunityimmunity）任任何何溶溶源源菌菌对对已已感感染染的的噬噬菌菌体体以以外外的的其其他他噬噬菌菌体体即即超超感感染染噬噬菌菌体体（不不管管是是温温和和的的还还是是烈烈性性的的）都都具具有有抵抵抗抗能能力力的的性性质质，也也称称为为超超感感染染免免疫疫性性，前前噬噬菌菌体体免免疫疫性性或或溶源性免疫性。溶源性免疫性。l l复复愈愈，在在溶溶源源性性细细菌菌的的增增殖殖过过程程中中有有1010-5-5的的个个体体丢丢失失前前噬噬菌菌体体，而而成成为为非非溶溶源源性性细细菌菌，这这一一过过程程叫叫做做复复愈愈或或非非溶溶源源化化，复复愈愈的的细细胞胞其其免免疫性也随之消失。疫性也随之消失。l l溶源转变（溶源转变（lysogenic conversionlysogenic conversion）少数溶少数溶源菌由于整合了温和噬菌体的前噬菌体而使自源菌由于整合了温和噬菌体的前噬菌体而使自己产生了除了免疫性以外的表型现象。己产生了除了免疫性以外的表型现象。溶原化与裂解循环检验溶源菌的方法l l是将少数溶源菌与大量敏感性指示菌（遇溶是将少数溶源菌与大量敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，然后加至琼脂培养基中倒一活周期者）相混合，然后加至琼脂培养基中倒一平板，过一段后溶源菌长成菌落。由于在溶源菌平板，过一段后溶源菌长成菌落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体发生自发裂解，释放的分裂过程中有极少数个体发生自发裂解，释放的噬菌体会不断的浸染溶源菌落周围的菌苔（指示噬菌体会不断的浸染溶源菌落周围的菌苔（指示菌的），形成一个中央有溶源菌菌落，周围有透菌的），形成一个中央有溶源菌菌落，周围有透明环的特殊的噬菌斑。明环的特殊的噬菌斑。（二）、植物病毒l l 植物病毒大部分属于ssRNA，基本形态有杆状、丝状和等轴对称的近球状二十面体，一般没有包膜，少数种有。植物病毒虽为严格的细胞内寄生，但专一性不强，一种病毒可在不同种、属甚至不同科的植物上寄生。1983年人们已经发现植物病毒600余种，其增殖过程基本与噬菌体相似，细节有别。（三）、脊椎动物病毒l l脊椎动物病毒主要寄生在人类及其它脊椎动物的脊椎动物病毒主要寄生在人类及其它脊椎动物的细胞内，占人类细胞内，占人类80%80%的传染病是由其引起的，估计的传染病是由其引起的，估计15%15%的恶性肿瘤也是有病毒引起的。另外家畜、禽的恶性肿瘤也是有病毒引起的。另外家畜、禽及野生动物，经济动物也有很多的病毒性传染病。及野生动物，经济动物也有很多的病毒性传染病。其增殖过程基本与噬菌体及植物病毒相类似，只其增殖过程基本与噬菌体及植物病毒相类似，只在一些细节上有所不同。步骤为吸附在一些细节上有所不同。步骤为吸附侵入侵入脱脱壳壳复制和增殖复制和增殖装配成熟和释放等。装配成熟和释放等。（四）、昆虫病毒l l昆昆虫虫病病毒毒的的研研究究和和开开发发起起步步较较晚晚，但但进进展展很很快快，19901990年年报报导导有有16711671种种。我我国国有有190190余余种种。它它们们80%80%以上是农、林业常见鳞翅目害虫的病原体。以上是农、林业常见鳞翅目害虫的病原体。l l大大多多数数病病毒毒可可在在宿宿主主细细胞胞内内形形成成包包涵涵体体，并并在在显显微微镜镜下下呈呈多多角角状状，因因此此称称为为多多角角体体。多多角角体体的的特特点：点：l l 外形为多角多面体。外形为多角多面体。l l 大小一般在大小一般在0.5-100.5-10m,m,多数多数3 3m m l l 成份系碱溶性结晶蛋白成份系碱溶性结晶蛋白 l l 内部包含数目不等的病毒粒子 l l 具有保护病毒的作用l l 可在细胞核或质内形成,根据是否形成多角体及其形态和部位,将昆虫病毒分为以下五类:l l1.1.核核 型型 多多 角角 体体 病病 毒毒(NPV,nuclear NPV,nuclear polyhedrosis polyhedrosis virus)virus)是是于于昆昆虫虫细细胞胞核核内内增增殖殖,具具有有蛋蛋白白质质包包涵涵体体的的杆杆状病毒其数目在昆虫病毒中首位。状病毒其数目在昆虫病毒中首位。l l2.2.质质 型型 多多 角角 体体(CPV,cytoplasmic CPV,cytoplasmic polyhedrosis polyhedrosis virus)virus)是是于于昆昆虫虫体体内内增增殖殖,具具有有蛋蛋白白质质包包涵涵体体的的一一种种球状病毒。球状病毒。l l3.3.颗颗粒粒体体病病毒毒(GV,granulosis GV,granulosis virus)virus)是是一一类类