微生物分离纯化接种与培养技术.pptx

细菌的分离纯化一、目的要求：1、学习微生物纯系分离、培养方法。2、掌握划线分离纯化微生物的方法。二、基本原理：为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（基本过程：（1）梯度稀释过程；（）梯度稀释过程；（2）分离培养过程）分离培养过程涂布涂布倾注倾注梯梯 度度 稀稀 释释 过过 程程10-110-210-310-410-510-6固体培养基分离纯培养、稀释倒平板法：稀释不同稀释液少许与50oC左右的琼脂培养基混合倾入平皿。2、涂布平板法：稀释倾入平皿不同稀释液少许涂布在琼脂培养基。3、平板划线分离法：少许待分离物平板划线（连续划线和分区划线）。4、稀释摇管法：待分离物用培养基稀释摇匀在琼脂表面封石蜡。液体培养基分离纯培养同一稀释度做多个平行管，95%表现为不生长。二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术4)操作要点：操作要点：无菌操作无菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：选择菌落接种的依据：a、菌落特征；、菌落特征；b、菌体的特征、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：微生物纯培养的标准：菌落特征一致性菌落特征一致性固体培养基分离纯培养菌落:单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时。平板（培养平板）：它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。3、平皿划线法、平皿划线法 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。2、单细胞挑取法：、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。得纯培养的过程。单细胞（单孢子）分离在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单细胞（单孢子）培养。选择培养分离1、利用选择培养基进行直接分离。2、富集培养（多次培养后再分离）二元培养物：培养物中含 有二种微生物。寄生物如病毒，原生动物如纤毛虫。为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。tupian 土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.三、材料与仪器1、培养基：阿斯毕无氮培养基。2、菜园土。3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等四、方法与步骤（一）富集培养：:(上次已做实验)1、加入1ML土壤菌悬液于灭菌平板2、加入已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基，混匀。3、正面放置培养箱中培养，28oC培养34天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。（二）划线分离纯化1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。划线方法如图：1234（三）纯化、镜检，得到纯种培养1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，28oC培养34天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。五、注意事项：（1）在微生物分离、纯化每一操作环节，要严格按照无菌操作进行。（2）平板划线时，划线部位不可重叠。（3）划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。（4）培养皿要贴标签，包括班级、姓名六、思考题1、分析阿斯毕培养基成分，说明其适用于分离自生固氮菌的原因。2、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？3、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？应注意哪些问题。