微生物原生质体融合育种.pptx
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1、Your Logo微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种姓名:付凤根姓名:付凤根Here comes your footer Page 2一、概述一、概述一、概述一、概述原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。原生质体:细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。原生质体融合:利用物理、化学或生物学方法,诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛
2、选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。Here comes your footer Page 3大幅提高亲本间的重组频率扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换、遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲优良性状机会更大。与常规杂交相比,原生质体融合具有的优势:不足之处:原生质体融合后DNA交换和重组随机发生,增加重组体分离筛选的难度。Here comes your footer Page 4二、微生物原生质体融合步骤与方法二、微生物原生质体融合步骤与方法二、微生物原生质体融合步骤与方法二、微生物原生质体融合步骤与方法遗传标记亲株筛选原生质体制备原生质体再生原生质体融合异核体检出重组
3、体检出和鉴定重组体的形态、生理生化和遗传分析原原原原生生生生质质质质体体体体融融融融合合合合步步步步骤骤骤骤Here comes your footer Page 5根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株,重组后的新个体具有更大的杂种优势。作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记,便于重组体的检出。常用的遗传标记有:带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。实际应用时究竟采用哪各遗传标记,可以根据试验目的确定。1 1、亲本及遗传标记的选择、亲本及遗传标记的选择Here comes your footer Page 6
4、2、原生质体制备、原生质体制备原生质体的分离收集纯化活性鉴定保存制备流程Here comes your footer Page 7制备原生质体,是原生质体技术的前提和基础,但是不同微生物的细胞壁组成各不相同,所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质,制备效果都不理想,目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于使用复合酶进行处理,常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等 不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同,而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素,酶浓度过大时,酶中往往含有对原生质体有害的酶
5、类(如过氧化物酶、核糖核酸酶等),随着酶量的增加,杂酶的浓度也会随之增加,当达到一定浓度时,必然会影响原生质体的活性;酶浓度过大,易使菌体凝集,难于原生质体化;而且,细胞脱壁太彻底,必然降低原生质体的再生率。2、原生质体制备、原生质体制备Here comes your footer Page 8菌龄:在菌龄的选择上,多采用对数生长期或生长中后期的菌,这是因为,菌体的不同生理状态直接影响到细胞壁的结构,对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。原生质体
6、制备液的p H值,也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在最适p H值时,酶的活性才最高,酶促反应速率才最大 影响原生质体形成的因素:Here comes your footer Page 9渗透压稳定剂:由于原生质体对渗透压非常敏感,渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着重要作用。常用的渗透压稳定剂有KCl,NaCl,CaCl2,Mg SO4,等无机盐和蔗糖、甘露糖、山梨醇等,一般说来,丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜,而酵母菌则使用糖或醇做稳定剂比较好。Here comes your footer Page 10 原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生。不同微生物的原生质体最适再生条件存在
7、一定的差异 培养基:在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。菌龄:菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体,有的细胞器不完全,营养供给不足再生能力也较低;菌龄长的原生质体再生率高。Ca2+:Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。3、原生质体再生、原生质体再生Here comes your footer Page 11原生质体悬浮液未酶解的细菌无菌水稀释高渗溶液稀释高渗溶液稀释培养培养培养计数再生率(%)=再生培养基上总菌落数酶处理后未原生质体化菌落数原生质体数1
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