微生物基本试验原理及操作.pptx
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1、微生物基本试验原理及操作 微生物基本试验l碳源和氮源利用试验l碳水化合物的代谢试验l各种酶类试验l氨基酸和蛋白质代谢试验碳源和氮源利用试验 l柠檬酸盐试验l葡萄糖酸盐试验柠檬酸盐试验 l原理:有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源,分解柠檬酸钠生成碳酸钠,使培养基呈碱性。能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌,也能利用铵盐作为唯一氮源,铵盐被分解为氨而产生碱性。西蒙氏柠檬酸盐培养基成分lMgSO4-7H2O0.2glNH4H2PO41glK2HPO41gl柠檬酸钠5gl氯化钠5gl琼脂20gl0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mll蒸馏水1000ml结果:阳性者表面上长有菌落,培养基变为蓝色。葡萄糖酸盐试验 l
2、原理:检查细菌是否具有氧化葡萄糖作为唯一碳源,并具有还原2-酮基葡萄糖酸盐与班氏试剂混合加热生成黄红色酮类的能力。l方法:接种大量待检菌于培养基内,35,24-48小时,0.5ml培养基加班氏试剂3滴左右,加热煮沸后观察结果。葡萄糖酸盐蛋白胨肉汤成分 l蛋白胨0.15gl酵母浸膏0.1gl磷酸二氢钾0.1gl葡萄糖酸钾(或钠)4gl蒸馏水100mll结果:出现黄色到橙红色沉淀为阳性,无颜色变化为阴性。碳水化合物的代谢试验 l氧化-发酵试验(OF试验)l糖醇发酵试验lB半乳糖苷酶试验(ONPG试验)l甲基红试验lVP试验l胆汁七叶苷试验氧化-发酵试验(OF试验)l原理:细菌在分解葡萄糖的过程中,
3、必须有分子氧参加的称为氧化型;在无氧条件下降解葡萄糖的称为发酵型;不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可以区别细菌的代谢类型。Hugh-Leifson二氏培养基(O-F培养基)成分l蛋白胨2gl磷酸氢2钾0.3克l氯化钠5gl葡萄糖10gl0.2%溴麝香酚蓝溶液12mll琼脂2.5gl蒸馏水1000mll方法:将待检菌接种于二支Hugh-Leifson培养基的试管中,均用接种针穿至管底,其中五支加入灭菌的液体石蜡约1厘米厚。35,培养48小时观察结果。培养基颜色变黄即为产酸。结果l代谢类型加蜡封口管开放管l发酵型产酸产酸l氧化型不变色产酸l产碱型不变色不变色l糖醇发酵试验 l原理:各种细菌
4、因含有发酵不同糖、醇类的酶,所以分解糖、醇类的能力各不相同。分解糖、醇类后产生的代谢产物可因菌种不同而异,有的产酸、产气,有的仅产酸,故用于鉴别细菌。糖、醇类试验培养基成分 l蛋白胨水或肉膏汤100mll所需的糖、醇或苷类0.5或1gl1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml结果 l接种的细菌,若能耐分解培养基中的糖类产酸时,则使培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒管内出现气泡。若不分解则无变化。B半乳糖苷酶试验(ONPG试验)l原理:有的细菌可产生B-半乳糖苷酶,此酶可分解邻-硝基酚-B-D-半乳糖苷(ONPG)。ONPG为无色,经B-半乳糖苷酶水解后,可产生黄色
5、的邻硝基酚,即使浓度很低也能检出。结果 l呈现黄色为阳性反应。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,本试验可作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。甲基红试验 l原理:某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等,而使培养基的pH下降至4.5以下,加入甲基红指示剂出现红色(阳性)。甲基红试验 l原理:有些细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其它物质(如醇、酮、醛、气体和水),则培养基的酸碱度仍在6.2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色(阴性)。葡萄糖蛋白胨水培养基成分l多价蛋白胨7gl葡萄糖5gl磷酸氢二钾5gl蒸馏水1000ml方法:被检菌接
6、种于上述培养基内,于35培养48小时,于2ml培养液内加甲基红指示剂2滴,立即观察结果。l结果:红色为阳性;桔红色为弱阳性;黄色为阴性。VP试验 l原理:有些细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸,丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧化为二乙酰(丁二酮),进而与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基发生反应,生成红色化合物,即VP反应阳性。培养基中的胍基太少时,加入少量含胍基的化合物,如肌酸或肌酸酐等,可加速此反应。试剂:甲液:6%a-萘酚乙醇溶液乙液:40%氢氧化钾溶液l方法:将被检菌接种葡萄糖蛋白胨水培养基后,于35培养48小时,于2ml培养基内加入甲液1ml
7、和乙液0.4ml,振摇后观察结果。l结果:于数分钟内呈红色为阳性;如无红色出现,而且于35中4小时后仍如故者即为阴性。本试验较为敏感。胆汁七叶苷试验l原理:在10-14%胆汁存在下,测定细菌水解葡萄糖苷七叶苷为七叶亭和葡萄糖的能力。胆汁七叶苷培养基成分 l蛋白胨5gl牛肉浸膏3gl牛胆汁(胆汁)40gl七叶苷1gl柠檬酸铁0.5gl琼脂15gl蒸馏水1000mll结果:培养基变为黑色或深褐色为阳性。有生长物时,并不表示七叶苷裂解,仅表示胆汁浓度不能抑制D群链球菌外的细菌生长。各种酶类试验l过氧化氢酶(触酶)试验l氧化酶试验l血浆凝固酶试验l硝酸盐还原试验l胆汁溶解试验l环腺苷酸(cAMP)试验
8、过氧化氢酶(触酶)试验 l原理:有些细菌具有过氧化氢酶,能将过氧化氢酶分解为水。l试剂:3%过氧化氢溶液。l方法:玻片法:用牙签挑取1824小时培养的菌苔,置于洁净的玻片上,滴加3%过氧化氢溶液12滴。试管法:取不含血液的1824小时培养物一接种环于试管内,加入1ml3%过氧化氢溶液。3%过氧化氢溶液应置于棕色瓶内冷藏。l结果:产生大量气泡为阳性,不产生气泡为阴性。血浆凝固酶试验 l原理:凝固酶能凝固血浆纤维蛋白,是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。本试验分玻片法和试管法,玻片法主要是检测结合凝固酶,试管法是为了肯定玻片法试验结果和对玻片法试验阴性者进行复查,检测游离凝固酶。血浆凝固酶试验l原理:
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