微生物学实验7土壤中细菌的分离纯化及计数资料.pptx
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1、实验七土壤中细菌的分离纯化及计数一、实验目的一、实验目的1 1、掌握微生物分离纯化的方法及步骤。、掌握微生物分离纯化的方法及步骤。2 2、掌握平板菌落计数的原则和方法。、掌握平板菌落计数的原则和方法。二、实验原理二、实验原理 平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的形成的菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即进行。即一长成的菌一长成的菌落代表一个活的细胞落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释,。计数时先将待测样品作一系列稀释,使其中的微生物充分分散成单个细胞,再吸取一定量的稀使其中的微生物充分分散成单个
2、细胞,再吸取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养单个细胞繁殖形成菌落,内,经培养单个细胞繁殖形成菌落,统计菌落数目即可计统计菌落数目即可计换算出样品的含菌数换算出样品的含菌数。环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起,环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起,为了为了获得纯种微生物,一般根据该微生物营养或培养特点,制获得纯种微生物,一般根据该微生物营养或培养特点,制作或设置一些选择性培养基,或选择性培养条件,再用作或设置一些选择性培养基,或选择性培养条件,再用稀稀释涂布平板法释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法
3、分离,纯化该微或稀释混合平板法或划线法分离,纯化该微生物,直至得到该纯种菌株。生物,直至得到该纯种菌株。1、牛肉膏蛋白胨培养基、土壤样品、无菌、牛肉膏蛋白胨培养基、土壤样品、无菌水水2、培养皿、玻璃试管、胶头滴管、涂布棒、培养皿、玻璃试管、胶头滴管、涂布棒三三、实验材料、实验材料四、实验步骤四、实验步骤1、细菌的分离纯化、细菌的分离纯化稀释涂布平板法稀释涂布平板法(1)试管和培养皿编号在试)试管和培养皿编号在试管壁上管壁上依次标上依次标上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。在培养皿。在培养皿养皿的底部依次养皿的底部依次标上标上10-4-1、10-4-2、10-5-1 10-5-2
4、、10-6-1、10-6-2。(2)倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化(微波炉加热)倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化(微波炉加热3min-5min),待培养基冷却至不烫手时(约),待培养基冷却至不烫手时(约50),无菌倒入已编号的),无菌倒入已编号的培养皿中,室温凝固,备用。培养皿中,室温凝固,备用。(3)土壤稀释液制备。称取)土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶无菌水的三角瓶中,震荡中,震荡15-20min,静置,静置约约2030秒,即成秒,即成10-1的土壤悬液。的土壤悬液。用胶用胶头滴管移取头滴管移取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-2的离心管中,震
5、荡混匀,制成的离心管中,震荡混匀,制成10-2的的菌悬菌悬液液;从;从10-2管中取管中取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-3的离心管中,震荡混的离心管中,震荡混匀,制成匀,制成10-3的的菌悬液;同法依次制备菌悬液;同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。的菌悬液。(5)涂布平板无菌操作,用胶头滴管分别移取)涂布平板无菌操作,用胶头滴管分别移取10-4、10-5、10-6稀释菌液各稀释菌液各200 uL于相应编号的培养皿中,于相应编号的培养皿中,用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。(注意:用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。(注意:涂布棒火焰灼烧,涂布棒火焰灼烧,冷却后再涂
6、布,否则温度太高导致冷却后再涂布,否则温度太高导致菌体死亡)菌体死亡)(6)培养及计数。将涂布好的平皿放入)培养及计数。将涂布好的平皿放入37培养箱中培养箱中倒置培养。倒置培养。2、菌落计数、菌落计数 培养培养48 h后取出培养皿,算出同一稀释度的三个平后取出培养皿,算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数,再按公式计算每毫升样品中活菌数。皿中平均菌落数,再按公式计算每毫升样品中活菌数。正置培养过程中,培养基中水分蒸发后,会在培养皿盖正置培养过程中,培养基中水分蒸发后,会在培养皿盖上冷凝形成水滴,一方面,水滴滴落至菌落表面,会将上冷凝形成水滴,一方面,水滴滴落至菌落表面,会将菌落打散,不易获得单
7、菌落;菌落打散,不易获得单菌落;另一方面,皿盖上形成水蒸气不利于结果的观察且容易另一方面,皿盖上形成水蒸气不利于结果的观察且容易造成培养基内水分蒸发。所以要进行倒置培养。造成培养基内水分蒸发。所以要进行倒置培养。平均菌落数平均菌落数某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数;某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数;CFUCFU菌落形成单位(菌落形成单位(colony-forming unitscolony-forming units,CFUCFU););0.2mL0.2mL每个平皿加入的菌悬液体积;每个平皿加入的菌悬液体积;100mL10100mL10-1-1菌悬液的体积;菌悬液的体积;10g10g称取的
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